Evaluación de la apoptosis según la técnica de obtención de Complejos Cumulus-Ovocitos inmaduros en porcinos

LORENZO, MS.; TELLO, MF.; GAMBAROTTA, MC.; LOMBARDO, DM.; FISCHMAN, ML.

Rosario

Jornada; Segundas Jornadas de Jóvenes Investigadores en Ciencias Veterinarias 2012; 2012

Universidad Nacional de Esperanza. Facultad de Ciencias Veterinarias .

En la vida de la hembra la mayoría de los folículos involucionan durante su desarrollo y el proceso de atresia que sufren se debe al proceso de apoptosis. Existen controversias sobre la manera en que la apoptosis afecta la capacidad de desarrollo del ovocito cuando éste es utilizado para tecnologías reproductivas in vitro. Por otra parte, la técnica de obtención de los Complejos Cumulus-Ovocitos (COCs), parece influir en su calidad; la recuperación de ovocitos por la técnica de slicing disminuyó significativamente la tasa de apoptosis temprana y tardía en los COCs inmaduros, respecto a la obtención por aspiración (1). Asimismo por la técnica de slicing se obtuvieron más ovocitos por ovario que por los métodos de disección o aspiración (2). Para evaluar apoptosis se utiliza la tinción con Annexina V, una proteína que al conjugarse con un fluorocromo, permite la detección de las células apoptóticas, ya que se une específicamente al fosfolípido de membrana fosfatidilserina, que se trasloca al comienzo de la apoptosis quedando expuesta en la cara externa. Esta tinción se complementa con la reacción TUNEL, que se basa en el uso de una enzima (Tdt), que cataliza la adición de dUTPs marcados con fluorocromos a los extremos 3´-OH presentes en el ADN fragmentado; la fragmentación nuclear es un fenómeno que ocurre tardíamente en la apoptosis. El Objetivo de este trabajo fue determinar la influencia de la técnica de obtención (slicing y aspiración folicular) en la presentación de apoptosis de COCs porcinos inmaduros. Para la obtención de COCs, los ovarios de cerda provenientes del frigorífico fueron transportados al laboratorio dentro de las 3 horas de extracción, a 30-35°C en un recipiente adiabático, y fueron lavados con NaCl 0,9% a 37°C. En la técnica de aspiración, los COCs se obtuvieron por punción aspiración de folículos de 3-8 mm utilizando una jeringa de 10 cc y aguja 18 G. En la técnica de slicing, se obtuvieron por cortes sucesivos de la superficie ovárica realizados con bisturí, siendo recuperados luego del medio donde se encontraban sumergidos los ovarios. Se realizaron sucesivos lavados con PVA-PBS (1mg/ml) y se clasificaron bajo lupa estereoscópica en 6 categorías, siguiendo el criterio de evaluación morfológica de Alvarez y col (3). Sobre los COCs obtenidos por ambas técnicas se realizó la tinción de AnexinaV-IP para la evaluación de apoptosis temprana (Invitrogen) y TUNEL para la evaluación de la apoptosis tardía (In Situ Cell Death Detection Kit 1684795 Roche). El análisis estadístico se realizó por medio de un ANOVA con dos factores, verificando normalidad por Shapiro Wilks, determinando diferencia estadísticamente significativa con p<0,1. La cantidad de COCs recuperados por ovario utilizando la técnica de aspiración fue, en promedio, de 11,79 mientras que ese valor ascendió a 26,66 por el método de slicing. Existieron diferencias significativas en los porcentajes de ovocitos que presentaron apoptosis temprana, siendo ésta mayor en los obtenidos por aspiración (p=0,06), mientras que no hubo diferencias en la distribución de apoptosis temprana entre las células del cumulus, presentando la mayoría de los COCs, para ambas técnicas, hasta en 25% de células positivas. La diferencia en cuanto a la cantidad de células del cumulus con apoptosis tardía fue altamente significativa (p=0,002) siendo mayor en aquellos COCs recuperados por aspiración, mientras que relativizando la cantidad de células positivas al área de cada COC, no se encontraron diferencias significativas, probablemente debido a que los COCs obtenidos por slicing tenian una menor superficie. La presencia de ovocitos y células del cumulus ip + (necrosis/apoptosis tardía) puede explicarse por la muerte inducida por el tiempo transcurrido y/o las condiciones de recolección y clasificación de los COCs. En conclusión, con la técnica de slicing se aprovecharon mejor los ovarios de hembras pre púberes (presentan folículos de menor tamaño) obteniéndose más cantidad de COCs por ovario y con mayor rapidez. La técnica aspiración folicular permitió seleccionar los folículos a aspirar evitando la punción de vasos, folículos hemorrágicos o excesivamente grandes, recuperando un líquido más limpio lo que facilitó su recolección y clasificación.La forma de evaluar/cuantificar el proceso apoptótico  difiere en la bibliografía consultada, no permitiendo una comparación entre los resultados obtenidos en los diferentes laboratorios. De todas formas, ésta es sólo una comparación entre COCs inmaduros, habría que determinar si existe una influencia de la técnica de obtención en los porcentajes de maduración in vitro de los ovocitos y cómo la apoptosis afecta la calidad de los ovocitos maduros.   Bibliografía 1: Romaguera R, Casanovas A, Morató R, Izquierdo D, Catalá M, Jiménez-Macedo AR, Mogas T, Paramio MT. Effect of follicle diameter on oocyte apoptosis, embryo development and chromosomal ploidy in prepuberal goats. Theriogenology, 2010, Vol. 10, 1016 2: Martino A., Palomo JM, Mogas T. Influence of the collection technique of prepuberal goats on in vitro maturation and fertilization. Theriogenology  42, 5: 859-873, 1994 3: Alvarez, G.M. y al., et., Immature oocyte quality and maturational competence of porcine cumulus-oocyte complexes subpopulations. Biocell (Buenos Aires) 33, 3: 166-177, 1999 4: Anguita Bustamante, Begoña. [ed.] Tesis doctoral: Estudio molecular y de apoptosis en ovocitos de cabras prepúberes y su relación con el desarrollo embrionario Unidad de Producción Animal del Departament de Ciència Animal i dels Aliments de la Universitat Autonoma. Barcelona, España : s.n., [2008].