Maduracion In Vitro De Complejos Cumulus Ovocito Bovinos En Cocultivo Con Celulas De Granulosa Bovina De Linea (BGC-1)

MARURI, A.; CRUZANS, PR.; TELLO, MF.; LOMBARDO, DM.

Buenos Aires

Jornada; Segundas Jornadas de Jóvenes Investigadores en Ciencias Veterinarias 2012; 2012

Subsecretaría de Ciencia y Técnica. Facultad de Ciencias Veterinarias. UBA.

La maduración in vitro (MIV) de ovocitos es un paso crucial en tecnologías de reproducción asistida en bovinos.  A los fines de optimizar los resultados obtenidos con los medios de maduración, las investigaciones han conducido al uso de cocultivos en monocapas de células somáticas para mejorar los índices de maduración nuclear y citoplasmática, así como la competencia  para el desarrollo posterior. Diversos estudios relacionan la presencia y distribución de la apoptosis en complejos cumulus ovocito (COCs) con la calidad de los mismos. El objetivo del trabajo es seleccionar la densidad de siembra de células granulosas bovinas de línea establecida  (BGC-1) para evaluar el efecto del cocultivo de los COCs bovinos durante la maduración in vitro. Los COCs fueron aspirados de folículos de 3-6 mm provenientes de ovarios de vacas faenadas, se seccionaron aquellos con varias capas de células del cumulus compacto y se lavaron tres veces en TCM199 suplementado con 5% de suero fetal bovino y gentamicina. Se probaron para las BGC-1 las siguientes densidades de siembra: 25, 50, 100 y 200 células/µL en un volumen (en gotas) de 100 µL utilizando dos medios de cultivo (DMEMF12 y TCM199),  evaluando el crecimiento por observación en microscopio invertido. Para el cocultivo de BGC-1 se sembraron 25 células/µL en gotas, 24 horas previas al agregado de los COCs (39°C, 5% CO₂). Grupos de 10 COCs se colocaron en gotas de maduración durante 22 horas con y sin cocultivo. Se evaluó la maduración nuclear en ovocitos denudados con las tinciones de Hoechst 33342 y Tarkowski considerando maduros aquellos que presentaron el estadio de metafase II. Se pusieron a punto técnicas de detección de apoptosis (Annexina V y TUNEL) en COCs. No se observaron diferencias en el crecimiento in vitro de BGC-1 a las 24 horas, entre los medios TCM199 y DMEMF12. Fueron descartadas las densidades de siembra mayores (200, 100 y 50) dado el posible efecto negativo generado por la depleción de nutrientes y producción de metabolitos. Los datos preliminares mostraron resultados similares en los porcentajes de MIV con y sin cocultivo que deben a posteriori ser analizados estadísticamente. Si bien los porcentajes de maduración nuclear son elevados en la especie bovina, los efectos del cocultivo deben ser evaluados en la eficiencia de los procesos posteriores (fecundación y desarrollo embrionario temprano).