NANOSISTEMAS LIPOSOMALES DE APLICACIÓN TÓPICA CON PENETRACIÓN CUTÁNEA Y ACTIVIDAD ANTITUMORAL

CALIENNI, M. N.; LLOVERA, R.; TEMPRANA, F.; ALONSO, S.; J. MONTANARI

Jornada; ESTADO ACTUAL DE LA NANOTECNOLOGIA y SUS APLICACIONES EN LAS CIENCIAS FARMACEUTICAS Y BIOQUIMICAS; 2017

ACADEMIA NACIONAL DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

NANOSISTEMAS LIPOSOMALES DE APLICACIÓN TÓPICA CON PENETRACIÓN CUTÁNEA YACTIVIDAD ANTITUMORAL N. Calienni1*; R. Llovera2; F.Temprana3; S. Alonso1; J. Montanari1 1Laboratorio deBiomembranas - GBEyB (IMBICE, CCT-La Plata, CONICET), Departamento de Ciencia yTecnología, Universidad Nacional de Quilmes, Bernal (B1876BXD), Argentina, Tel:+54 11 43657100 int. 56252Laboratorio deExpresión y Plegamiento de Proteínas - GBEyB (IMBICE, CCT-La Plata, CONICET),Departamento de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Quilmes, Bernal(B1876BXD), Argentina 3Laboratorio deVirología, Departamento de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional deQuilmes, Bernal (B1876BXD), Argentina *nati.calienni@gmail.com Resumen: Se encapsularon dos fármacos con propiedades antitumoralesen liposomas ultradeformables con el fin de desarrollar nuevos tratamientos deaplicación tópica. Los principios activos elegidos fueron el 5-Fluorouracilo(droga clásica) y el Vismodegib (droga de última generación). Ambos sonutilizados durante la terapia contra algunos tipos de cáncer de piel, medianteadministración parenteral con severos efectos secundarios no deseados. Los nanosistemasobtenidos fueron caracterizados fisicoquímicamente, se determinó su capacidadpara penetrar la piel, y su toxicidad o actividad antitumoral in vitro en una línea celular derivadade queratinocitos humanos no tumoral y en una línea de origen melanómico. Por último, se estudió el efecto de laco-encapsulación del 5-Fluorouracilo con un extracto natural de arándanos. Introducción: El 5-Fluorouracilo (5FU) es una droga que se usa desde hace más de 40años en el tratamiento de diversos tipos de cáncer, incluyendo algunos tipos deneoplasias de la piel. El Vismodegib (Vis) es una droga de última generaciónrecientemente aprobada por la Food andDrug Administration de EE.UU., utilizada en el tratamiento de adultoscon carcinoma de células basales. Si bien ambos principios activos handemostrado ser efectivos para revertir los eventos neoplásicos, presentannumerosos y severos efectos secundarios cuando son administrados por la víaparenteral. Por lo tanto, la encapsulación del 5FU y el Vis dentro de nano-drug delivery systems permitereducir los efectos secundarios y realizar una entrega sitio-específica en lazona del tumor.Seseleccionó como nanosistema a los liposomas ultradeformables (UDL), porque sonla única clase de liposomas capaces de penetrar el estrato córneo de la piel yliberar su contenido en la epidermis viable y dermis1. Su elevadadeformabilidad a temperatura ambiente y corporal se debe a las característicasfísico-químicas que le aporta la presencia de la sal biliar colato de sodio encombinación con la fosfatidilcolina de soja. Sellevó a cabo una exhaustiva caracterización físico-química de los nanosistemascon 5FU (UDL-5FU) y Vis (UDL-Vis). En el caso del 5FU, además, se co-encapsuló unextracto etanólico de arándanos (Vacciniummyrtillus) (UDL-5FU-EA), dado que existe evidencia de que su co-encapsulacióncon flavonoides produce un efecto sinérgico antitumoral2.Parael caso de UDL-5FU y UDL-5FU-EA, se estudió la actividad antitumoral in vitro mediante diversas técnicas,comparando su efecto en dos líneas derivadas de piel humana: HaCaT, provenientede queratinocitos inmortalizados (no tumoral) y SK-Mel-28, derivada de melanoma(tumoral). Se estudióla penetración de UDL-5FU y UDL-Vis en piel humana en condiciones ex vivo, en las cuales se simularon las condiciones in vivo de aplicación, tales como elgradiente de humedad transdérmico y la temperatura de la piel.  Materiales y métodos:Obtención y caracterización de los nanosistemas: Los UDLfueron preparados a partir de la resuspensión con buffer Tris de un film lipídico de fosfatidilcolina desoja y colato de sodio que se formó mediante rotoevaporación3. Elextracto fue obtenido a partir de arándanos disgregados a los cuales se lesrealizó una extracción con etanol ácido, eliminado por rotoevaporación4.El 5FU y el extracto de arándanos fueron añadidos durante la hidratación del film. Mientras que el Vis se añadió durantela formación del film lipídico. Los UDL-5FUy UDL-5FU-EA fueron sonicados, mientras que UDL-Vis extrudados por una membranade 100 nm de tamaño de poro, con el fin de obtener en todos los casos vesículasunilamelares de alrededor de 100 nm de tamaño. La droga no encapsulada fueremovida mediante cromatografía de exclusión molecular. Se estudió su tamaño yestabilidad en el tiempo mediante dynamiclight scattering, potencial-Z y microscopía electrónica de transmisión. Sedeterminó la interacción de los principios activos con la membrana liposomalmediante calorimetría diferencial de barrido y se llevaron a cabo estudios dela deformabilidad de las formulaciones.Actividad antitumoral e internalización: Los estudios in vitro se realizaron en las líneascelulares HaCaT y SK-Mel-28. Se determinó la citotoxicidad de UDL-5FU y UDL-5FU-EAmediante MTT, cristal violeta y rojo neutro a las 4 y 24 hs de tratamiento. Sedeterminó la inducción de apoptosis y necrosis mediante citometría de flujoluego de 6 hs de incubación, mediante el kit de detección con Anexina V-FITC. Porúltimo, se estudió la internalización de las formulaciones marcadasfluorescentemente a 4 y 37ºC.Penetración en piel: Se estudió la capacidad de UDL-5FU yUDL-Vis para atravesar el estrato córneo de la piel humana mediante el Modelode Penetración de Saarbrücken en condición no oclusiva5. En el casodel 5FU se cuantificó por espectrometría UV-Vis, mientras que el Vis medianteHPLC, a distintas profundidades en el estrato córneo, luego de someter a lapiel a la técnica de tape stripping5.Además, se estudió el perfil de penetración de los UDL-5FU marcados con dossondas fluorescentes mediante microscopía confocal de cortes histológicos y z-stacking de un fragmento intacto depiel. Resultados:Actividad antitumoral: UDL-5FUy UDL-5FU-EA mostraron efectos citotóxicos semejantes entre sí. Si bienafectaron tanto a la línea tumoral como la no tumoral, incrementaron de manerasignificativa el efecto citotóxico del 5FU en SK-Mel-28 después de 24 hs detratamiento. Sin embargo, SK-Mel-28 mostró una mayor internalización de ambasformulaciones en comparación a HaCaT a 4 y 37ºC, y a partir de los estudios deapoptosis se observó un efecto diferenciado entre ambas líneas. Después de 6 hsde incubación UDL-5FU y UDL-5FU-EA indujeron un elevado porcentaje de apoptosissólo en la línea tumoral y mayor que el de 5FU libre. Sin embargo, UDL-5FU-EAincrementó el porcentaje de células necróticas en HaCaT en comparación con UDL-5FUy 5FU libre.Penetración en piel: TantoUDL-5FU como UDL-Vis lograron atravesar el estrato córneo de la piel,detectándose tanto 5FU como Vis en la epidermis viable y dermis. Sin embargo,el Vis fue hallado en mayor proporción en el estrato córneo (ambientehidrofóbico), mientras que el 5FU se encontró en mayor proporción en laepidermis viable y dermis (ambiente más hidrofílico).  Conclusión: Se obtuvieronformulaciones liposomales estables que encapsulan 5FU y Vis, capaces depenetrar la piel humana intacta en menos de una hora. En el caso de laformulación con 5FU además se observó que presenta efecto antitumoral in vitro. La co-encapsulación del 5FU conun extracto etanólico de arándanos no modificó su actividad antitumoral, sinembargo, produjo una inducción de necrosis no deseada en la línea celular dequeratinocitos humanos no tumoral. Referencias:1Cevc & Blume (1992), Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes,1104(1) 226-2322Cosco D., et al. (2015) International journal of pharmaceutics, 489(1):1-103Montanari J., et al. (2007), International journal of pharmaceutics, 330(1):183-944Montanari J., et al. (2013), Journal of cosmetic science, 64 (6),469-4815Montanari J., et al. (2010) Journal of Controlled Release,147(3):368-76 Agradecimientos: Roche Argentina por ladonación del Vismodegib para poder llevar a cabo este trabajo.