PRODUÇÃO DE VETORES VIRAIS TIPO AMPLICON PARA TERAPIA GÊNICA: NOVO SISTEMA DE PURIFICAÇÃO BASEADO EM RECOMBINAÇÃO CRE/LOX SÍTIO-ESPECÍFICA

PAULA AGUSTINA BENEGAS; MATIAS ELISEO MELENDEZ; BRUNA PEREIRA SORROCHE

Barretos

Encuentro; VIII Encontro Científico do Hospital de Câncer de Barretos; 2016

Núcleo de Apoio ao Pesquisador (NAP)

Introdução: Os vetores virais de tipo Amplicon, derivados do vírus da Herpes simplex humana tipo 1, são vetores virais extremamente versáteis e simples de produzir, utilizados em diversas áreas da biologia molecular, como por exemplo, transferência gênica, síntese de anticorpos monoclonais, estudo de doenças neuro-motoras e desenho de vacinas. A estrutura do plasmídeo amplicon necessário para a produção destes tipos de vetores virais defectivos, formada por um backbone canônico de plasmídeo bacteriano que carrega uma sequência de empacotamento herpética (pac) e uma origem de replicação herpética (oriS), tem permanecido de maneira inalterada desde os primeiros protocolos de produção de vetores amplicons. aNo entanto, (i) a contaminação por partículas virais helper que aportam em trans todas as proteínas necessárias para o empacotamento do plasmídeo Amplicon em partículas virais herpéticas, e (ii) a presença de DNA de origem bacteriano no plasmídeo amplicon (responsáveis pela ativação da resposta imune e pelo silenciamento gênico do transgene), limitam a sua utilização em protocolos de terapia gênica. Objetivo: Assim, o objetivo do presente projeto é construir um novo sistema de produção de vetores amplicons, baseado em recombinação sítio-específica Cre/lox, que permita eliminar as sequencias de origem bacteriana dos vetores virais de tipo amplicon, obtendo assim vetores amplicons aptos para protocolos de terapia gênica. Materiais e Métodos: Inicialmente realizamos a construção do plasmídeo pCR2.1gC.OPNE, que contém uma estrutura de plasmídeo canônica, um gene repórter EGFP e um cassette amplicon (pac e oriS) flanqueado por dois sítios loxP unidirecionais. Posteriormente, testamos a construção, (i) transfectando o plasmídeo pCR2.1gC.OPNE nas linhagens celulares Vero e VCre4 (linhagem celular que expressa a enzima Cre recombinase), e (ii) transformando o plasmídeo pCR2.1gC.OPNE em bactérias Escherichia coli SW106, que expressam a enzima Cre em presença de Arabinose. Resultados: Como resultado observamos que, após transfecção, o gene repórter EGFP foi expresso somente nas células que expressam a enzima Cre recombinase (VCre4), indiretamente demonstrando que houve circularização do cassette amplicon após a excisão sitio-especifica Cre/loxP, como esperado. Alem disso, após transformação e indução de expressão da enzima Cre recombinase nas bactérias SW106, o plasmídeo pCR2.1gC.OPNE foi corretamente clivado, demonstrando mais uma vez, que a circularização do cassette amplicon após a excisão sitio-especifica Cre/loxP foi bem executada. Conclusão: Assim, acreditamos que a eliminação das sequências bacterianas presentes no plasmídeo poderão diminuir a resposta inflamatória e o silenciamento dos transgenes transportados por estes tipos de vetores virais, melhorando significativamente o sistema quando comparado com os sistemas de produção de vetores amplicons tradicionais.