EVALUACIÓN DE ESPECIES REACTIVAS DEL OXÍGENO EN OVOCITOS PORCINOS SOMETIDOS AL PROCESO DE VITRIFICACIÓN-ATEMPERADO

PABLO DANIEL CETICA; APARICIO A; SERGIO ADRIÁN MORADO; PINCHETTI D; GABRIEL MARTIN ALVAREZ

buenos aires

Jornada; V Jornadas Internacionales del Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal (INITRA); 2017

INITRA

Con el objetivo de evaluar la calidad de ovocitos porcinos madurados in vitro vitrificados por el método de mínimo volumen Cryotech®, se cuantificó luego del proceso de atemperado la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS). Los ovarios se obtuvieron de hembras porcinas faenadas y transportados en termos hasta el laboratorio. Los complejos ovocito-cúmulus (COCs) inmaduros se obtuvieron por aspiración de folículos ováricos antrales y seleccionados bajo lupa estereoscópica. Se utilizaron ovocitos completamente rodeados por un cúmulus íntegro y denso. Los COCs fueron madurados en medio 199 con sulfato de gentamicina, fluido folicular porcino, FSH y LH, bajo aceite mineral a 39°C, 5% CO2 en aire y 100% de humedad durante 48 hs. Luego fueron denudados de forma mecánica con pipeta Pasteur fina previa incubación con hialuronidasa. Los ovocitos se vitrificaron (n=95) utilizando crioprotectores permeables (etilenglicol, dimetilsulfóxido), componentes osmóticamente activos (trealosa) y como soporte una lámina fina para ingresar directamente al Nitrógeno líquido. Para su atemperado se utilizaron soluciones de trealosa en concentraciones decrecientes en sucesivos pasajes hasta llegar a soluciones isotónicas. Los ovocitos se evaluaron a 3 tiempos (0, 3 y 21 hs) siendo sus respectivos controles los ovocitos que no han sido sometidos al proceso de vitrificación-atemperado. Para medir las ROS se incubaron en PBS adicionado con polivinilalcohol (PVA) y 2?,7?-diclorodihidrodiacetato de fluoresceína (DCHF-DA). Para evaluar la actividad de esterasas un grupo de ovocitos fue incubado en PBS adicionado con PVA y diacetato de fluoresceína (FDA). Se obtuvieron microfotografías digitales con un microscopio de epifluorescencia, las imágenes se analizaron utilizando el software IMAGE J. Al ser los niveles de fluorescencia de DCHF-DA dependientes de la actividad de esterasas intracelulares, el cociente entre la luminosidad obtenida por DCHF-DA para cada ovocito y el promedio de luminosidad por FDA de cada tratamiento fue considerado como medida relativa del nivel de ROS producido por cada ovocito. La producción de ROS fue significativamente mayor a tiempo cero, decreciendo tanto a tiempo 3 como 21 hs en frescos y en vitrificados-atemperados (P