Evaluación de mezclas con proteínas recombinantes de Mycobacterium bovis para el diagnóstico específico de tuberculosis bovina

MARIA LAURA MON; ROBERTO DAMIÁN MOYANO; MARIANA VIALE; IGNACIO JOSÉ GAMIETEA; VALERIA NOELY MONTENEGRO; BERNARDO ALONSO; MARIA DE LA PAZ SANTANGELO; ROMANO MARIA ISABEL

La Plata

Congreso; III Congreso Panamericano de Zoonosis y VIII Congreso Argentino de Zoonosis; 2014

Asociación Argentina de Zoonosis

INTRODUCCIÓN:  La tuberculosis continúa siendo una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo.  El agente más común  de la tuberculosis humana es M. tuberculosis, pero una proporción de casos  son  debido  a Mycobacterium  bovis,  el agente  causante  de  la  tuberculosis  bovina  (TBB).  A  esta  última  están  principalmente expuestos  los  trabajadores  rurales  y  de  frigorífico,  así como,  los  que  consumen  leche cruda sin pasteurizar.  En Argentina, durante 2004-2005, fueron recogidas 448 muestras de esputos de pacientes con diagnóstico de TB, donde  el 2% de  estas  TB pulmonares fueron  debido  a  M.  bovis.  Sin  embargo  estos  resultados  son  sesgados  debido  a  que muchos  de  los  casos  de  TB  humana  por  M.  bovis  son  extrapulmonares.  Por  su implicancia en Salud Humana y las perdidas económicas que produce al productor es necesario  el  control  y  erradicación  de  la  TBB.  El  diagnóstico  oficial  de  TBB  en Argentina  es  la  prueba  tuberculina  aplicando  un  derivado  proteico  purificado  de  M. bovis  (PPD-B).  Esta prueba  consiste en la determinación del incremento de grosor de la piel  debido  a  la  reacción  de  hipersensibilidad  retardada  después  de  la  inyección intradérmica  de  esta  me zcla  antigénica.  En  otros  países  para  el  diagnóstico  de  TBB también se utiliza la prueba   que  mide liberación de gamma interferón  (IFN-)  luego de estimular  los  linfocitos  T  con  PPD-B.  Este  reactivo  constituido  por  diferentes componentes, tales como proteínas, lípidos, hidratos de carbonos e incluso ADN,  puede dar reacciones positivas en animales con paratuberculosis  y/o sensibilizados con otras micobacterias. En este estudio se evalúo mezclas con conocidas proteínas antigénicas de M. bovis  y proteínas  obtenidas de fracciones altamente inmunoreactivas  de la PPD-B, con el objeto de mejorar la especificidad en el diagnóstico de TBB. MATERIALES  Y  MÉTODOS:  En  el  presente  trabajo  se  elaboraron  dos  mezclas conteniendo proteínas recombinantes de M. bovis: Mezcla 1(M1): con ESAT-6, CFP-10 y MPB83; y mezcla 2 (M2): con ESAT-6, CFP-10, MPB83, HspX, TB10:3 y MPB70. Además,  se  identificaron  nuevas  proteínas  antigénicas  en  los  lotes  de  PPD-B actualmente  en  uso.  Para  dicha  identificación  se  separó  la  PPD-B  en  fracciones  por electroforesis  en  geles  de  poliacrilamida,  y  en  las  fracciones  que  demostraron  ser fuertemente  antigénicas  en  animales  experimentalmente  infectados  con  M.  bovis,  se identificaron  las  proteínas  por  espectrometría  de  masas.  Se  elaboraron  mezclas antigénicas  con estas proteínas  y  se  evaluaron  en  cobayos  sensibilizados con  M. bovis(n=5)  y  M. avium  (n=5),  y en bovinos  vacunados con BCG  (n=5), experimentalmente infectados  con  M.  bovis  (n=6),  naturalmente  expuestos  a  M.  bovis  (n=58)  y  a Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, el agente de la paratuberculosis (n=17). RESULTADOS:  En  el  presente  estudio  las  mezclas  M1,  M2  y  PPD-B  aplicadas intradérmicamente  en  cobayos  sensibilizados  con  M.  bovis  mostraron  respuestas similares.  Sin embargo, M1 indujo una respuesta significativamente menor que la PPD B en cobayos sensibilizados con  M. avium, demostrando la potencialidad de M1 para utilizar  en  el  diagnóstico  específico  de  TBB.  En  bovinos,  se  evaluó  la  liberación  de IFN-g  producida  por  M1,  M2  o  PPD-B.  Los  mejores  resultados  de  sensibilidad especificidad  fueron  obtenidos  con  M1,  desde  que  esta  mezcla  detectó  los  animales experimentalmente infectados con  M. bovis  a todos los tiempos evaluados, con mínima detección  de  animales  vacunados  con  BCG  o  con  paratuberculosis  (PTB).  Para optimizar estas mezclas, se obtuvieron diferentes fracciones de la PPD-B y estas fueron evaluadas  en  animales  experimentalmente  infectados  con  M.  bovis.  En  las  fracciones más inmunogénicas se identificaron 7 proteínas: MPB70, MPB83, CFP10, CFP2, FixB, PepA, HspX y una secuencia que parcialmente correspondía a una proteína de M. bovis (Tabla 1). Al  evaluar en un rodeo con TBB  la liberación de IFN-g producida por  M1 con el agregado de  FixB, aumentó el reconocimiento de animales con TBB,  sin detectar animales en un rodeo con paratuberculosis. DISCUSIÓN:  Nuestros  resultados  nos  permitieron  avanzar  en  el  conocimiento  de mezclas  de antígenos que  permiten detectar animales con TBB sin interferencia por la presencia de animales sensibilizados o infectados con otras micobacterias.  El presente proyecto constituye un claro ejemplo de biotecnología aplicada al mejoramiento de la Salud Humana  y Animal, desde que el mejoramiento en el  control de la enfermedad en el  ganado,  incidirá  drásticamente  en  la  incidencia  de  infección  por  M.  bovis  en humanos, y además permitirá una mayor rentabilidad a la industria cárnica y lechera.