Evaluacion de métodos de amplificación isotérmica para el desarrollo de sistemas point of care, utilizando un modelo viral

BERGIER JULIAN; GHIRINGHELLI DANIEL; BILEN MARCOS

Buenos Aires

Encuentro; XXXVI Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2016

SAV

Los sistemas de detección de ácidos nucleicos son ampliamente utilizados en el área de diagnóstico, industria e investigación debido a su sensibilidad especificidad y rapidez. Sin embargo, la mayoría de estos sistemas utilizan tecnologías asociadas a equipos sofisticados y costosos. En la actualidad existe un fuerte desarrollo de nuevos sistemas de detección rápidos, sensibles, y de bajo costo denominados (POC). Estos sistemas, son particularmente útiles, cuando se requieren resultados inmediatos, por ejemplo en una epidemia, o en lugares con escaso acceso a centros de salud.Una de las etapas en el proceso de detección de ácidos nucleicos es la amplificación de los mismos. Las metodologías más utilizadas se encuentran asociadas a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Sin embrago existen otros tipos de tecnologías isotérmicas más eficientes y más económicas como RCA (), LAMP () o PSR (). OBJETIVOEste trabajo tiene como objetivo estudiar y evaluar la performance de diferentes metodologías de amplificación isotérmica de ácidos nucléicos, para ser acopladas a dispositivos de detección molecular tipo .METODOLOGÍA Y RESULTADOSEn este trabajo se evaluaron dos metodologías de amplificación isotérmica: RCA y PSR. Para esto se utilizó como modelo de estudio al virus de Dengue (DENV). A partir del análisis bioinformático de genomas de DENV, se diseñaron los requeridos en cada tecnología. Se analizaron diferentes parámetros de reacción (temperatura, enzimas polimerasas, cofactores, adyuvantes, oligonucléotidos) para estudiar la influencia de los mismos en la eficiencia de la reacción. A partir de las condiciones de reacción seleccionadas se evaluó la sensibilidad del sistema utilizando cantidades conocidas de molde inicial. Se logró detectar entre 100-1000 moléculas, en las condiciones estudiadas. Por otro lado, para evaluar la especificidad de los productos amplificados se utilizaron reacciones de digestión enzimática y secuenciación. Los resultados obtenidos fueron comparados con metodologías de PCR en tiempo real. CONCLUSIÓNLas tecnologías de amplificación isotérmica de ADN, presentan ventajas comparativas en cuanto a costos y tiempo, respecto a metodologías asociadas a PCR. La sensibilidad obtenida es comparable a las metodologías de referencia. Sin embargo, en cuanto a la especificidad de la reacción hemos observado productos inespecíficos de amplificación que deben ser estudiados aún. Debido a la sensibilidad y al factor de amplificación de la metodología evaluada, sería posible acoplar este tipo de reacción a métodos de revelado más económicos (colorimétricos, electroquímicos), que faciliten el desarrollo de sistemas