EVALUACIÓN DE FUERZA DE TRACCIÓN CELULAR Y CINÉTICA DE DISOCIACIÓN DE PROTEÍNAS ADHESIVAS MEDIANTE MICROSCOPÍA MULTIDIMENSIONAL

LORENA SIGAUT; MICAELA BIANCHI; LÍA I PIETRASANTA

San Carlos de Bariloche

Congreso; 4° Congreso de la Asociación Argentina de Microscopía (SAMIC 2016); 2016

Asociación Argentina de Microscopía SAMIC

Las células sensan activamente la rigidez de su entorno, ejerciendo fuerzas de tracción a través de complejos macromoleculares denominadas adhesiones focales (AF), que unen físicamente componentes del citoesqueleto con la matriz extracelular, y sirven como puntos de integración para las señales químicas y mecánicas. La regulación de la adhesión celular a la matriz extracelular y la generación de fuerzas de tracción son cruciales para el mantenimiento de la forma celular, la migración y la mecanotransducción; y tienen un rol importante en varios procesos biológicos, como por ejemplo cicatrización, inflamación, embriogénesis o metástasis. La Microscopía de Fuerza de Tracción (TFM) es una técnica que permite cuantificar las fuerzas de tracción generadas por las células adheridas a un sustrato elástico, a partir del procesamiento y análisis de imágenes de nanomarcadores fluorescentes embebidos en el sustrato que actúan como referencia1. Si el sustrato es suficientemente blando, la fuerza que ejerce la célula lo deforma entre decenas y centenares de nanómetros, y mediante el análisis de velocimetría por imágenes de partículas (PIV), es posible calcular el campo de deformaciones del sustrato a partir de las imágenes de fluorescencia. Para obtener las fuerzas de tracción generadas por las células basándose en las deformaciones del sustrato y sus propiedades elásticas, se resuelve un problema inverso de mecánica de medios continuos, empleando un método de Regularización de Tikhonov2. Con el fin de estudiar los efectos de la elasticidad del sustrato en la generación de fuerzas cultivamos células de epitelio mamario de ratón (HC11) sobre sustratos de poliacrilamida de diferente elasticidad. A partir de los experimentos de TFM confeccionamos mapas de fuerzas de tracción sobre diferentes sustratos, observando que la magnitud de la fuerza generada por las células aumenta al cultivarlas sobre sustratos más rígidos. La cinética de la proteína zixina, considerada la una de las proteínas mecanosensoras de adhesión focal, fue evaluada mediante la recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP)3. Asumiendo que la cinética de discociación de la zixina desde la adhesión focal es mucho más lenta que la difusión de la proteína libre, el análisis de la curva de recuperación de la fluorescencia nos permitió estimar la constante de discociación de la zixina. De esta manera, el análisis de la cinética de la zixina mediante FRAP reveló una disminución de la constante de disociación a medida que aumenta la rigidez del sustrato. Con el objetivo de correlacionar la posición de las adhesiones focales, las fuerzas ejercidas por las células y la cinética de la proteína zixina, se implementaron en forma conjunta TFM y FRAP en células transfectadas que expresan la proteína zixina fusionada a EGFP. El análisis de los datos indicaría una posible correlación (a nivel de adhesión focal) entre la cinética de disociación de zixina y la magnitud de las fuerzas de tracción ejercida por una adhesión focal: sugiriendo que ejercerían mayor fuerza de tracción las adhesiones focales que presentan una menor constante cinética de disociación para la zixina.