Microscopía 3D por barrido orbital y modulación radial

LAURA ESTRADA; CECILIA ZAZA; MANUELA GABRIEL

San Miguel de Tucuman

Congreso; 101º Reunión de la Asociación Física Argentina; 2016

Filial Tucumán

La reconstrucción tridimensional de estructuras en la micro y nanoescala ha sido un tema de intensa investigación en los últimos años. Stimulated Emission Depletion (STED), Photo-activated localization microscopy (PALM), y STochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) son algunas de las técnicas hoy en día más comúnmente utilizadas. Mientras que STED está basada en la reducción del tamaño del haz de iluminación a partir de la desexcitación selectiva por emisión estimulada, PALM y STORM se basan en el principio de que un emisor individual se puede localizar con una precisión que depende del número de fotones colectados. Ambos enfoques han sido exitosamente utilizados en numerosos ejemplos logrando producir imágenes de gran calidad con una resolución espacial de algunas pocas decenas de nm y dependiendo del tamaño de la imagen algunas decenas de segundos de resolución temporal. Sin embargo, dado la relativamente baja resolución temporal, para la aplicación de estos métodos es esencial que la muestra de interés esté inmovilizada durante la adquisición de la imagen.En este trabajo presentamos un método alternativo basado en el barrido orbital de un haz de excitación alrededor de la estructura de interés. Esta tecnología es capaz de producir imágenes tridimensionales de estructuras fluorescentes con resolución nanométrica y en pocas decenas de milisegundos. El método se basa en el hecho de que cuando el haz de excitación se acerca a un objeto fluorescente, la intensidad de luz emitida depende de la distancia del haz de excitación a lasuperficie del objeto. Modulando la distancia entre el haz de excitación y el objeto, y teniendo en cuenta la no-linealidad del perfil del haz de excitación, es posible obtener para la señal de fluorescencia colectada, una respuesta oscilatoria cuya amplitud depende únicamente de la distancia a la superficie del objeto [1]. Además, dado que el haz de excitación está en todo momento en lasinmediaciones de la estructura de interés, es posible medir especímenes que estén en movimiento.En este trabajo presentaremos simulaciones numéricas que demuestran el funcionamiento del método así como experimentos control en muestras tridimensionales fluorescentes fabricadas por litograf´ıa óptica. Mostraremos un ejemplo en una planta modelo (Arabipdosis Thaliana) para la reconstrucción tridimensional de raíces de 50 mum de longitud y 5 µm de diámetro en condicionesfisiológicas. Finalmente, mostraremos que se puede reemplazar el sistema de enfoque tradicional, basado en el movimiento mecánico del objetivo, por un sistema simple con una lente eléctricamente sintonizable, aumentando así en 1 orden de magnitud la velocidad y en 2 órdenes de magnitud el rango de barrido.