Cultivo y purificación de células de cuerpo lúteo porcino como sustrato para la maduración in vitro de complejos cumulus ovocito porcinos. Establecimiento y caracterización

TEPLITZ GM; MARURI A; CAROU MC; BERTONAZZI AE; LOMBARDO DM

Congreso; VI Congreso Peruano de Reproducción Animal, Asociación Peruana de Reproducción Animal; 2016

Teniendo presente los resultados obtenidos a partir de ovocitos madurados y fecundadosin vivo, la producción in vitro (PIV) de embriones porcinos es aún una biotecnologíaineficiente. En comparación con estudios realizados en otras especies animales, lamaduración nuclear y citoplasmática no han sido bien descritas en el cerdo, reflejadoesto en inconvenientes para la formación de pronúcleos y la existencia de polispermia.La utilización de un cocultivo estandarizado recrearía de mejor forma el ambiente en elcual se desarrollan estos procesos in vivo. La elección de células de cuerpo lúteo porcinas(CL) en monocapa para cocultivo de complejos cumulus ovocito (COC) se fundamenta ensu capacidad esteroidogénica, con producción basal de progesterona (P4). Esta hormonaposee un efecto antiapoptótico debido a una expresión de Fas por debajo de los nivelesbasales (downregulation) y a su efecto antioxidante. A su vez, la P4, es un mediador dela reanudación meiótica inducida por el aumento de gonadotropinas. El objetivo de estetrabajo fue establecer y caracterizar el cultivo de células de luteales porcinas (CLP) parael posterior cocultivo de COC porcinos, a fin de disminuir los niveles de estrés oxidativoy la apoptosis inducida por especies reactivas del oxígeno (ERO), promoviendola maduración ovocitaria. Para el establecimiento y purificación del cultivo de CLP serealizó la disección de cuerpos lúteos obtenidos a partir de ovarios de frigorífico. El tejidoluteal se sometió a digestión mecánica y enzimática con colagenasa IV. La suspensión sefiltró y centrifugó y se diluyeron las células en 10 mL de medio DMEM-F12 suplementadoy se sembraron en 2 frascos de cultivo T25, manteniéndose en incubadora en ambientecontrolado y renovando el medio cada 48 h, luego las células de pasaje 1 se sometierona una centrifugación diferencial en gradiente discontinuo de Percoll®. Para el análisis ycaracterización del mismo se realizó la evaluación del contenido de lípidos intracelularespor tinción con rojo Nilo, la inmunocitoquímica (ICQ) para 3β-hidroxiesteroidedeshidrogenasa (3β-HSD) y la determinación de P4 por ELISA. Como resultado se observóla presencia de gránulos lipídicos citoplasmáticos con características diferenciales en lasdistintas fases recuperadas luego de la centrifugación diferencial en gradiente dePercoll®, una producción de P4 en forma creciente medida a las 48, 96 y 144 h decultivo primario y casi la totalidad de las células positivas a la evaluación ICQ para 3β-HSD, observando la capacidad esteroidogénica de las células en cultivo. Se realizaronensayos preliminares de MIV de COC en cocultivo con cultivo de CLP y evaluación de lamaduración nuclear observando, por el momento, porcentajes similares entre eltratamiento y el control con el agregado de hormonas. Estos resultados permitirían laoptimización de la producción in vitro de embriones porcinos y su posible transferenciatecnológica a los sistemas productivos.