La helicasa NS3 del virus del dengue cataliza en un mismo sitio la hidrólisis de los nucleótidos ATP, GTP, CTP y UTP

J. JEREMÍAS INCICCO; RODOLFO M. GONZÁLEZ-LEBRERO; LEOPOLDO G. GEBHARD; ANDREA V. GAMARNIK; SERGIO B. KAUFMAN

Los Cocos, Córdoba

Congreso; Reunión anual de la SAB; 2009

Sociedad Argentina de Biofísica

El genoma del virus del dengue codifica una poliproteína que es clivada por peptidasas para dar tres proteínas estructurales y siete proteínas no estructurales. Entre estas últimas la denominada NS3 presenta las características distintivas de las helicasas y posee actividades enzimáticas que resultan esenciales para la replicación del virus [1-3]. Las helicasas, como la proteína NS3, realizan el trabajo mecánico de separar los pares de bases de dos cadenas complementarias de ARN o ADN, acoplando para ello la energía libre de hidrólisis de nucleósidos trifosfato (NTPs). Se sabe que la NS3 del virus del dengue cataliza la hidrólisis de diversos NTPs y que esta actividad se ve incrementada por la presencia de ARN tanto de simple como de doble cadena. En trabajos previos hemos estudiado la especificidad [considerada según la magnitud del parámetro (kcat/KM)] de la NS3 por los nucleótidos ATP, GTP, CTP y UTP en ausencia de ARN [4]. En este trabajo nos proponemos establecer si la hidrólisis de los cuatro sustratos mencionados se produce en el mismo sitio catalítico de la proteína. Para responder este interrogante establecimos un criterio experimental de aplicación que sustituye con ventajas las usuales ‘curvas de desplazamiento’ empleadas en casos análogos. Las determinaciones de actividad NTPasa se efectuaron a 25ºC cuantificando el fosfato liberado en medios de reacción conteniendo: MOPS/KOH (pH 6.5) 25mM, KCl 100mM, EDTA 0.5mM, Mg2+ libre 1.5mM y glicerol 3%. Dado que el procedimiento experimental adoptado exigió contar con las curvas de sustrato de cada nucleótido, en la práctica significó obtener nuevamente la serie de parámetros (kcat/KM). En esta oportunidad, se llegó a una nueva secuencia de especificidad: GTP >ATP >CTP >UTP que, en principio, rectifican los resultados anteriormente informados. La segunda serie de resultados experimentales reveló que la hidrólisis de los nucleótidos ATP, GTP, CTP y UTP se produce en un mismo sitio catalítico de la NS3. Con subsidio UBACyT. Referencias: [1] Padmanabhan R, et al. , (2006) Novartis Found Symp. 277: 74-84; discussion 84-6, 251-3. [2] Yon, H.C., et al., (2005). J Biol Chem. 280(29): 27412-27419. [3] Matusan AE, et al., (2001) J Virol. 75(20): 9633-9643. [4] Silvana Fucito, Tesis Doctoral, Departamento de Química Biológica, FCEyN, UBA, 2008, 65-77.