MÉTODOS Y CRITERIOS PARA VALIDAR Y COMPARAR APTÁMEROS O SECUENCIAS DE ADN EN SU UNIÓN A PROTEÍNAS ADHERIDAS A NITROCELULOSA EN FORMA NATIVA O DESNATURALIZADA

CRISTIAN JORGE ALEJANDRO ASENSIO; C. MASSE EDERRA; M. MASSIP COPIZ; M. CLAUZURE; A. G. VALDIVIESO; T. A. SANTA COLOMA

Mar del Plata

Congreso; LX REUNIÓN DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE INVESTIGACIÓN CLÍNICA (SAIC); 2015

SAIC

Determinar cuali/cuantitativamente la unión del ADN a proteínas adheridas a nitrocelulosa y caracterizarla como específica son objetivos en las etapas de selección de aptámeros de ADN. La especificidad es importante cuando el blanco proteico de los aptámeros se debe detectar en una mezcla compleja de proteínas.En la actualidad, pocos aptámeros de ADN han sido validados en su especificidad en la presencia de mezclas complejas como es necesario con los lisados celulares en south-western. Para facilitar las mencionadas caracterizaciones ensayamos dos tipos de formato: a) el dot-blot para péptidos y proteínas nativas puras y b)el south-western para proteínas recombinantes desnaturalizadas y lisados. Establecer criterios y controles que permitan monitorear la eficacia de los procesos de selección en estos formatos, ahorrando tiempo y esfuerzo, es un importante tema a desarrollar en el área. Para identificar y caracterizar la señal de fondo debida a la unión inespecífica con las proteínas utilizamos una batería de oligonucleótidos y librerías sintéticos de distinta longitud,secuencia y estructura secundaria o topología. Comparamos la unión a varias proteínas y lisados cuando dichos oligonucleótidos están en forma de cadena simple o doble. También utilizamos como controles proteínas o péptidos que pegan ADN inespecíficamente por interacción electrostática u otro tipo de interacciones.Tuvimos en cuenta el efecto de los buffers de unión, el pH y la concentración de iones como así también el tipo de bloqueante de la nitrocelulosa. Encontramos que los perfiles de proteínas que unen ADN varían de un tipo celular a otro pero ciertas estrategias o criterios de selección son aplicables a cualquiera y permiten ayudar a determinar si una proteína es seleccionable dentro de una mezcla compleja. También estudiamos proteínas catiónicas, que basalmente unen ADN, como caso extremo de blanco proteico de aptámeros. Proponemos además un uso proteómico del ADN.Agradecimientos UCA