EL ESPIN TRAP DMPO PROTEGE EL PULMON EXPUESTO A ENDOTOXINA MEDIANTE LA INTERFERENCIA CONLA VIAS DE SENALAMIENTO DEL NF-KB

GOMEZ-MEJIBA, SANDRA; GIMENEZ, MARIA SOFIA; MASON, RP; RAMIREZ, DARIO

Congreso; VIII CONGRESO NACIONAL DE ESTUDIANTES DE BIOQUIMICA, BIOTECNOLOGIA Y BIOLOGIA MOLECULAR; 2013

El espin trap DMPO protege el pulmón expuesto a  endotoxina mediante la interferencia con las vías de señalamiento del NF-kB  Gomez-Mejiba, S.E.1; Gimenez, M.S.1; Mason, R.P.2 & Ramirez, DC1 1Laboratorio de Medicina Experimental y Terapéuticas, IMIBIO-SL-CCT San Luis-CONICET-UNSL, San Luis, Argentina.   2Laboratory of Toxicology and Pharmacology, NIEHS, NIH, DHHS, RTP, NC, USA.   Introducción El pulmón es un órgano crítico debido a un número de factores relacionados a su superficie de exposición al medio ambiente y al metabolismo [1]. Además, la microvasculatura pulmonar contiene 30-veces más neutrófilos que cualquier otra vasculatura en nuestro cuerpo [2]. Esto se debe a la circulación lenta de los neutrófilos debido a su tamaño (~11 µm) en relación al de la luz vascular (~7 µm). Por lo tanto, pequeños cambios en el estatus inflamatorio sistémico o local podría causar no solo mayor contenido en neutrófilos sino también causar su activación. La activación de los neutrófilos está ligada a la producción de especies reactivas del oxigeno (ROS). Mieloperoxidasa (MPO) es una de las proteínas más abundante en los neutrófilos. Esta enzima usa H2O2 para oxidar aniones cloruros a uno de las ROS mas oxidantes que se conoce en biología, hipoclorito (HOCl). Esta especie puede modificar lípidos, proteínas, ácidos nucleicos y carbohidratos causando serios daños a nivel pulmonar. Este daño oxidativo induce inflamación a nivel local y es una fuente importante de citocinas pro-inflamatorias a nivel sistémico. Proponemos que estrategias dirigidas a reducir o la acumulación y/o activación de neutrófilos en la vasculatura pulmonar podrían ser efectivas para prevenir el daño oxidativo causado por irritación de las vías respiratorias causada por inhalación de estresores ambientales, tales como la endotoxina bacteriana-lipopolisacarido (LPS). Por otro lado los espin traps han sido desarrollados en los 60?s para el estudio de radicales libres en química [3]. Entre ellos los de tipo nitrona tienen baja toxicidad, pasan atreves de las membranas biológicas y son efectivos atrapadores de radicales libres. Al atrapar radicales libres, los espin traps pueden interferir en el proceso de oxidación de macromoléculas y por lo tanto servir como efectivos agentes antiinflamatorios. Entre los espin traps tipo nitrona 5,5-dimetil-pirrolina N-oxido (DMPO) es uno de los menos tóxicos y mejor estudiados. Proponemos investigar cuales son los mecanismos mediante los cuales DMPO puede afectar el mecanismo de daño de las vías respiratorias de ratones expuestos a LPS. Basados en los datos preliminares propusimos la siguiente hipótesis: El efecto protector de DMPO contra los efectos inflamatorios del LPS en el pulmón actuaría, al menos en parte, mediante su propiedad para interferir en la retención de neutrófilos en la microvascultura pulmonar.   Métodos Para lograr nuestro objetivo se usó un modelo de síndrome de distrés respiratorio agudo (ADRS) usando una única instilación intratraqueal de LPS con o sin pre-tratamiento por la misma vía con DMPO. Los ratones machos (C57BL/6J, 7 semanas de edad, peso 23±2 g) fueron divididos en 4 grupos (G#1-4). Los ratones fueron tratados por instilación intratraqueal 1 h antes con vehículo (PBS estéril, S) o DMPO (D, 5 nmol /ratón) seguido una h después (Tiempo=0) con LPS (L, 50µg/ratón) o S. Así quedaron  definidos 4 grupos de 5 ratones cada uno por experimento: G#1: PBS/PBS (S/S), G#2: DMPO/PBS (D/S), G#3:PBS/LPS (S/L), and G#4: DMPO/LPS(D/L). Los experimentos fueron terminados 24 h después de la instilación de LPS. Los experimentos se repitieron 3 veces para obtener poder estadístico necesario para sacar conclusiones validas de este estudio. Se estudió el daño al ADN, apoptosis e inflamación en el suero, el sobrenadante y las células del lavado broncoalveolar (BALF), el homogenato de pulmón (Western blot) y cortes de pulmón (immunohistoquímica). Figura 1. Daño oxidativo e inflamación del pulmón de ratones expuestos a endotoxina vía instilación intratraqueal. A y B) Láctico desidrogenasa (LDH) y proteínas en el BALF fueron determinadas como parámetros de daño de la membrana celular; C) TNF-a en homogenatos de pulmón fue determinado como parámetro de inflamación; D) neutrófilos y MPO en BALF fueron determinados como parámetros de inflamación neutrofílica; E) el contenido de carbonilos en homogenatos de pulmón fue determinado como parámetro de daño oxidativo; F) DMPO nitrona aductos fueron determinados en BALF, homogenatos de pulmón y suero; G) Antes del tratamiento los ratones fueron tratados con vehículo o un inhibidor de MPO (ABAH) o un scavenger de HOCl (taurina). El trabajo con animales estuvo en estricto acuerdo con las reglas establecidas en la ?Guide for the care and use of animals in research? del National Institutes of Health de los Estados Unidos de América (Protocolo #076-08-RamirezLab-OMRF). Resultados Se observó que DMPO (D/S) no afectó el estado general de los animales con respecto a aquellos instilados con vehículo (S/S). Ratones administrados con LPS mostraron sintomatología de caquexia y astenia luego de 24 h. LPS (S/L) produjo incremento en neutrófilos, daños oxidativos e inflamación pulmonar (Fig. 1).  La instilación de DMPO 1 h antes de LPS (D/L) redujo la cantidad de neutrófilos y MPO en el pulmón, protegió la arquitectura del pulmón, redujo la concentración de TNF-a en BALF, redujo la expresión de iNOS y COX-2 en homogenatos de pulmón, y redujo el número de células TUNEL positivas (apoptosis) en pulmón. Estos datos son consistentes con el hecho que si se previene la retención de los neutrófilos (Figs. 1 y 2), su posterior activación y todos los efectos genotóxicos posteriores serían prevenidos. Figura 2. Efecto de DMPO sobre la inflamación neutrofílica en el pulmón de ratones instilados con LPS. Microscopía laser-confocal del pulmón de ratones pre-tratados a la -1h con vehículo o DMPO y luego instilados con 50 mg LPS/ratón. La figura inferior es una magnificación de la sección marcada en la figura superior. La barra de medida es 50 mm. En azul se marcan los núcleos (DAPI), en verde MPO y en rojo un marcador de neutrófilos (NIMP-R14). Los datos son representativos de 3 experimentos individuales.  Debido a una menor retención de neutrófilos en el pulmón (Fig. 2), todos los efectos dependientes de la activación de los neutrófilos y la producción de HOCl en el pulmón (eje. Daño oxidativo al ADN y producción de KC y citoquinas pro-inflamatorias) fueron significativamente menores cuando los ratones fueron pre-tratados con DMPO en relación a aquellos ratones pre-tratados con el vehículo (Ver Fig. 1). El efecto del pre-tratamiento con DMPO fue también mimetizado por el pre-tratamiento con ABAH-un inhibidor de MPO, GSH-una de las principales formas de protección pulmonar contra la formación de radicales libres, N-acetilcisteina (NAC)-una fuente de GSH, o resveratrol-que entre otros mecanismos reaccionada con HOCl dentro de las células [4]. DMPO redujo la expresión de ICAM-1, una de las muchas moléculas de adhesión bajo el control de NF-kB y que participa en la adhesión de neutrófilos al epitelio y endotelio de las vías respiratorias (Fig. 3).   Figura 3. DMPO reduce la expresión de ICAM-1 en el pulmón expuesto a endotoxina. A) Efecto dosis dependiente de LPS sobre la expresión de ICAM-1 y el daño a la arquitectura pulmonar ; B) Efectos dosis-dependiente de DMPO sobre la expresión de ICAM-1 y el daño pulmonar inducido por endotoxina. C) Western blot mostrando los efectos inhibidores de DMPO sobre la expresión de ICAM-1 en el pulmón expuesto a endotoxina. Conclusiones La disminución de la retención de neutrófilos en el pulmón expuesto a endotoxina por DMPO se debería a una serie de propiedades farmacológicas que recientemente hemos publicado en relación al efecto de DMPO en la activación de macrófagos por LPS [5]. Estos estudios han mostrado que DMPO previene la activación de NF-kB el cual es fundamental para la producción de un número de quimoquinas, citoquinas y moléculas de adhesión para neutrófilos en las células epiteliales irritadas por endotoxina (Fig. 4). Figura 4. DMPO interfiere en la activación del NF-kB. Si DMPO es administrado antes de la irritación causada por endotoxina, entones este protege al pulmón mediante su habilidad para inhibir la activación del NF-kB y posterior síntesis de moléculas pro-inflamatorias y moléculas de adhesión [5]. Por lo tanto disminuye la retención y la activación de neutrófilos en la microvasculatura pulmonar. Nuestros datos siguieren que DMPO actuaria disminuyendo la retención de neutrófilos en el pulmón, al menos en parte, mediante su habilidad para interferir en las vías de señalamiento del NF-kB gatilladas por LPS en la expresión de moléculas de adhesión a nivel microvasculatura pulmonar. En conclusión, además de su poder antioxidante, DMPO puede ser un tratamiento efectivo para reducir la infiltración de neutrófilos en pacientes en riesgo de irritación de las vías aéreas, como ocurre en pacientes sépticos y en fibrosis quística.  Mas estudios sobre el efecto de DMPO en las vías de traducción de señales que controlan la expresión de moléculas de adhesión y sobre la fisiología celular son necesarios antes que el espin trap pueda ser usado en humanos. Referencias [1] S.E. Gomez-Mejiba, Z. Zhai, H. Akram, Q.N. Pye, K. Hensley, B.T. Kurien, R.H. Scofield, D.C. Ramirez, Inhalation of environmental stressors & chronic inflammation: autoimmunity and neurodegeneration, Mutat Res, 674 (2009) 62-72. [2] A.M. Knaapen, R.P. Schins, D. Polat, A. Becker, P.J. Borm, Mechanisms of neutrophil-induced DNA damage in respiratory tract epithelial cells, Mol Cell Biochem, 234-235 (2002) 143-151. [3] E.G. Janzen, Spin trapping, Methods Enzymol, 105 (1984) 188-198. [4] S.E. Gomez-Mejiba, M.S. Gimenez, Z. Zhai, D.C. Ramirez, Trapping of protein-centered radicals with a nitrone spin trap prevents endotoxin-induced experimental acute respiratory distress syndrome mouse model, Free Radic Biol Med, 49 (2010) S184. [5] Z. Zhai, S.E. Gomez-Mejiba, H. Zhu, F. Lupu, D.C. Ramirez, The spin trap 5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide inhibits lipopolysaccharide-induced inflammatory response in RAW 264.7 cells, Life Sci, 90 (2012) 432-439.