ACUMULACION DE NEUTROFILOS, INSULINO RESISTENCIA Y ESTRES OXIDATIVO EN RATONES OBESOS EXPUESTOS A ENDOTOXINA

DELLA-VEDOVA, MC; GOMEZ, NN; RAMIREZ, DARIO; GOMEZ-MEJIBA, SANDRA

Congreso; VIII CONGRESO NACIONAL DE ESTUDIANTES DE BIOQUIMICA, BIOTECNOLOGIA Y BIOLOGIA MOLECULAR; 2013

UNSL

Acumulación de Neutrófilos, Insulino Resistencia y Estrés Oxidativo en ratones obesos expuestos a Endotoxinas. Della Vedova M.C.1, Gomez, N.N.1, Gomez-Mejiba,1 S.E. & Ramirez, D.C.1-2 1Laboratorio de Medicina Experimental y Terapéuticas, IMIBIO-SL-CCT San Luis­CONICET-UNSL, San Luis, Argentina. Introducción La obesidad es una enfermedad inflamatoria crónica con origen en la interacción de factores nutricionales, genéticos, epigenéticos, ambientales y socio-económicos, que se caracteriza por un desequilibrio entre la energía consumida y la energía gastada, lo que conduce a la hipertrofia del tejido adiposo [1] La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que en el 2005, 400 millones de personas eran obesos, 1,6 millones de personas tienen sobrepeso y 20 millones de ellos son niños menores de 5 años de edad. En los Estados Unidos y en Argentina se estima que más del 30% de los adultos es obeso [2-4]. La OMS y los Institutos Nacionales de Salud (NIH) categorizan a adultos y niños de acuerdo a su Índice de Masa Corporal (IMC= kg/m2) en peso normal (IMC< 25), sobrepeso (25<IMC<30) y obesos (IMC>30) [5]. Algunas de las medidas de uso común de la obesidad abdominal son circunferencia de cintura, de la cadera y la relación cintura-cadera [6]. La obesidad es un factor de riesgo para un número de enfermedades metabólicas crónicas, incluyendo, diabetes mellitus, hipertensión, enfermedades cardiovasculares, neurológicas, inmunológicas, cáncer y enfermedades pulmonares [7-8] La acumulación de tejido adiposo en la obesidad puede atenuar las defensas pulmonares del organismo huésped a través de trastornos metabólicos en donde se almacenan el exceso de calorías en forma de triacilglicerol (TAG). Normalmente cuando la capacidad de acumulación de triglicéridos en el tejido graso subcutáneo ha sido saturada, la acumulación continúa con depósito de grasa visceral que genera un cambio morfológico, funcional e inflamatorio en la misma [9]. Como consecuencia, estos lípidos aumentan en la circulación periférica y se acumulan en sitios ectópicos, tales como el músculo esquelético, el hígado, y los islotes del páncreas que conduce a la resistencia a la insulina y la hiperglucemia [10]. Además, el tejido adiposo elabora citoquinas proinflamatorias (TNF-a, IL-6, IL-1b, IL-18, MCP-1), adipoquinas proinflamatorias tales como la leptina y resistina, y produce menos adipoquinas antiinflamatorias tales como la adiponectina [11-13]. Las citoquinas Proinflamatorias reclutan neutrófilos que representan el 60% de los leucocitos que circulan en la sangre periférica. Éstos son células del sistema inmunológico innato que fagocitan bacterias y cuerpos extraños y desencadenan procesos de injuria que dependen o no del oxigeno, que culminan en la muerte del organismo fagocitado y la del neutrófilos[14-15]. Los neutrófilos contienen tres tipos de gránulos recubiertos por una membrana, gránulos primarios o azurófilos que contienen mieloperoxidasa (MPO), los gránulos secundarios o específicos que contienen principalmente lactoferrina y los gránulos terciarios que contienen principalmente gelatinasa [16]. MPO es la proteína más abundante en los neutrófilos y es la única enzima que produce ácido hipocloroso (HOCl), uno de los oxidantes más fuertes en la biología que causa modificaciones en proteínas, lípidos, carbohidratos y ácidos nucleícos [16]. La consecuencia de estos eventos es la inflamación sistémica que puede en última instancia, afectar a la función inmune innata y adaptativa mediante la inducción de estrés de retículo endoplasmático, lipotoxicidad, el estrés oxidativo, y la resistencia a la Leptina [12, 15]. El lipopolisacarido (LPS, componente de la membrana externa de bacterias Gram negativas) es uno de los mayores contaminantes encontrados en el polvo doméstico y que al igual que el humo de cigarrillo causa inflamación pulmonar y por lo tanto una mayor cantidad de mediadores de la inflamación en circulación y una disminución de la sensibilidad a la insulina [17-18].Hay evidencias que muestran una mayor incidencia de enfermedades cardiovasculares y cardiopulmonares en áreas de polución, las cual se correlaciona con el nivel de contaminantes en el aire durante las horas pico de tráfico automovilístico y el IMC en pacientes [19-20]. Sin embargo, aun no se ha prestado atención al pulmón como blanco de estos mediadores en el compartimento sistémico y sus consecuencias metabólicas en la obesidad. La microvasculatura pulmonar (diámetro promedio 5 um) es una de las más sensibles a los cambios en el perfil oxido/inflamatorio del compartimiento sistémico debido a la riqueza en neutrófilos (12 um) en relación a la microvasculatura de otros órganos.[18, 21] Objetivo Por lo antes expuesto, hipotetizamos que el pulmón obeso retiene mayor número de neutrófilos que el pulmón de individuos de peso normal debido a la mayor expresión de moléculas de adhesión, como consecuencia del efecto de mediadores de la inflamación sobre la microvasculatura pulmonar. Haciendo al pulmón obeso más sensible al estrés oxidativo impulsado por irritantes del aire, tales como endotoxina bacteriana (lipopolisacarido, LPS) y por lo tanto contribuiría a un incremento en la concentración de mediadores de la inflamación en el suero de sujetos obesos que inhalan endotoxina y de ese modo contribuirían a la resistencia a la insulina. Métodos y Resultados Para probar esta hipótesis hemos usado ratones machos C57BL/6 los cuales fueron alimentados por 20 semanas con a una dieta rica en grasas (grupo obeso, 60% Kcal provistas por grasa saturada) o baja en grasas (grupo control, 10% Kcal provistas por grasa saturada). Para estos experimentos se prevé disponer de 6 animales por dieta. El agua y comida serán provistas ad-libitum y los animales serán mantenidos en el bioterio de la UNSL-IMIBIO-SL con un régimen de luz oscuridad de 12 h cada uno. Todos los estudios fueron llevados a cabo de acuerdo a las guías institucionales para el uso de animales de experimentación. Los primeros experimentos fueron llevados a cabo en el LARC-OMRF. Al finalizar el régimen de alimentación el volumen pulmonar de los ratones obesos y control fueron determinados mediante imagen molecular resonante (MRI, Molecular Resonance Imaging). Estos estudios mostraron que el volumen pulmonar de ratones obesos fue menor (P<0.05) que el de los ratones controles y que el volumen pulmonar no se correlacionaba con la concentración de citoquinas pro-inflamatorias en circulación (Fig. 1A). 24 hrs. antes del sacrificio se realizo la Instilación intratraqueal con LPS (50µg/ratón) (ITI). Se realizo el test de tolerancia a la glucosa antes y después de la instilación con LPS y se observo que hay un aumento significativo de los niveles de glucosa cuando se trata a los ratones con la endotoxina. Figura 1: Características inflamatorias del pulmón obeso. A) Molecular Resonance imaging (MRI) del pulmón obeso (obese o HFD) muestra un volumen menor que el pulmón de ratones controles (lean o LFD). B) Nivel de MPO, IL-6 y clorotirosina en el pulmón obeso o delgado expuesto o no a lipopolisacarido bacteriano (LPS). C) Nivel de TNF-α en el pulmón obeso y control, datos representativos o valores medios  SEM de 3 experimentos separados. D) Imagen confocal que muestra la distribución de MPO en neutrofilos (NIMP-14+) que infiltran el tejido pulmonar en el pulmón obeso. La actividad de MPO, clorotirosina e IL-6 fueorn medidas por ELISA en homogenatos de pulmón (Fig. 1B). TNF-α fue medido por ELISA (Fig. 1C), mostraron que hay un incremento de MPO, clorotirosina (un marcador de la oxidación de residuos tirosinas en proteínas por HOCl), IL -6 y TNF-α en los ratones obesos comparados con los controles (p< 0.05). Figura 2: ICAM-1 y su rol en la retención de neutrófilos en el pulmón obeso. A) Imagen de ICAM-1 mostrando su distribución en el pulmón obeso; B) Análisis por Western blot de la presencia                                                                                                                             de MPO e ICAM-1 en el pulmón de ratones obesos y controles.                                                                                                                            Se muestra                                                                                                                              una imagen representativa de 3 experimentos individuales. El análisis de moléculas que participan en la unión de neutrófilos al epitelio respiratorio mostro un incremento en ICAM-1 (Fig. 2). ICAM-1 tiene un rol fundamental en la retención de neutrófilos en los estrechos capilares de la microcirculación pulmonar. Conclusiones La retención de neutrófilos en el pulmón obeso seria un potencial blanco terapéutico para reducir la inflamación sistémica e IR en pacientes obesos expuestos a irritantes de las vías respiratorias. 1.            Nguyen, D.M. and H.B. El-Serag, The epidemiology of obesity. Gastroenterol Clin North Am, 2010. 39(1): p. 1-7. 2.            Bautista, L.E., et al., The Latin American Consortium of Studies in Obesity (LASO). Obes Rev, 2009. 10(3): p. 364-70. 3.            Filozof, C., et al., Obesity prevalence and trends in Latin-American countries. Obes Rev, 2001. 2(2): p. 99-106. 4.            Kennedy, A., et al., Saturated fatty acid-mediated inflammation and insulin resistance in adipose tissue: mechanisms of action and implications. 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