Efecto in vitro de la preparación proteolítica del látex de Vasconcellea quercifolia (Caricaceae) sobre la coagulación sanguínea

TORRES M JOSÉ; DE ARAÚJO VIANA CAROLINA; ERRASTI M EUGENIA; NATALUCCI CLAUDIA; VIANA RAMOS MARCIO; LÓPEZ LAURA M I

Buenos Aires

Jornada; XII Jornada de Farmacia y Bioquímica Industrial JorFyBI 2015; 2015

Asociación Argentina de Farmacia y Bioquímica Industrial SAFYBI

IntroducciónEl desarrollo de nuevos fármacos puede lograrse a partir del estudio de sustancias contenidas en plantas y hierbas. La enorme biodiversidad de plantas que posee Argentina nos plantea la posibilidad de identificar sus actividades biológicas para aplicarlas a terapéuticas de enfermedades de nuestra población.En respuesta a una lesión, los frutos de Vasconcellea quercifolia (Caricaceae) responden rápidamente para detener la pérdida de látex mediante formación de un coágulo alrededor de la herida, fenómeno similar al observado en los tejidos de mamíferos expuestos a un trauma al detener la pérdida de sangre. Durante la coagulación del látex se produce el procesamiento de péptidos concomitantemente con la activación secuencial de enzimas proteolíticas, semejante a lo que ocurre en mamíferos. Las similitudes entre ambas procesos de coagulación nos llevaron a plantear que factores análogos pueden estar presentes en ambos sistemas y que posiblemente metabolitos vegetales que intervienen durante la cicatrización de la planta, también pueden actuar durante el proceso en mamíferos.Previamente, a partir del látex de frutos inmaduros de Vasconcellea quercifolia A.St.-Hil, una especie de la familia Caricaceae que crece en Argentina, hemos obtenido una preparación enzimática con elevada actividad proteolítica, la cual hemos caracterizado bioquímicamente y denominado Vq. Esta preparación mostró ser activa en un amplio rango de pH (con valores superiores al 80% de la actividad máxima entre pH 6,7 y 10,0) y presentado actividad también a pH ácido, elevada estabilidad térmica y la actividad enzimática prácticamente no se ve afectada por altas concentraciones salinas . A partir de la preparación Vq purificamos por métodos cromatográficos siete peptidasas cisteínicas que fueron caracterizadas e identificadas estructuralmente empleando herramientas de proteómica .Materiales y Métodos Preparación proteolítica. El látex fue obtenido practicando incisiones superficiales en los frutos de V. quercifolia y recibido sobre buffer cítrico-citrato 0,1M de pH 5,6 conteniendo EDTA 5mM y tetrationato de sodio 1mM. La preparación fue centrifugada a 11500 g durante 20 min, obteniéndose un sobrenadante límpido que fue denominado Vq.Actividad Coagulante. Para los ensayos se utilizó plasma sanguíneo obtenido de donantes sanos (la sangre fue recolectada sobre citrato trisódico y centrifugada a 500g durante 15 min a temperatura ambiente). La actividad coagulante se determinó de acuerdo al procedimiento descripto por Condrea et al . Se colocaron 30 µl de la muestra de V. quercifolia disuelta en buffer Tris-HCl 10 mM de pH 7,5 conteniendo DTT 3 mM y 300 µl de plasma citratado, luego de incubar 1 min a 37 ºC se indujo la formación del coágulo por adición de 30 µl de CaCl2 0,25 M. Se registró el tiempo necesario para la formación de un coágulo visible a partir del momento del agregado de CaCl2. Los ensayos se realizaron por triplicado, y como control se reemplazó la muestra por buffer.Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada (APTT) y Tiempo de Pro-Trombina (PT). Se emplearon kits comercial de Wiener lab. y los ensayos fueron realizados siguiendo las instrucciones del fabricante. Previamente100 µl de plasma humano fueron incubados con 10 µl de muestra Vq disuelta en buffer Tris-HCl 10 mM de pH 7,5 conteniendo DTT 3 mM, durante 2 min a 37ºC. Las determinaciones se realizaron por triplicado y como control negativo se usó el buffer.Ensayo de formación e hidrólisis de coágulos de fibrina. El ensayo fue realizado de acuerdo al método de Shivaprasad et al . En la cubeta del espectrofotómetr se colocaron 700 µl de solución de fribrinógeno humano (5 mg/ml) en buffer Tris HCl 10 mM de pH 7,5 y 70 µl de muestra. La formación del coágulo de fibrina (aumento de turbidez) y su hidrólisis (descenso) por las peptidasas fue seguida por medida de la absorbancia a 540 nm durante 30 min. Como control negativo se empleó el buffer. ResultadosLa preparación proteolítica Vq logró disminuir notoriamente el tiempo de coagulación con respecto al control, siendo dicho tiempo un 75% menor para la preparación sin diluir y un 40% menor para una dilución 1/2. Para determinar si el efecto coagulante de las proteasas es ejercido sobre la cascada intrínseca o extrínseca de la coagulación, se ensayaron el Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada (APTT) y el tiempo de Protrombina (PT). Vq disminuyó de manera significativa el valor de APTT, sugiriendo una afectación del sistema intrínseco de coagulación.Por otra parte, con el fin de determinar un probable sitio de acción de las peptidasas en la cascada de coagulación se ensayó la actividad fibrinógeno y fibrinolítica mediante el análisis de formación e hidrólisis de coágulos de fibrina por espectrometría. La preparación Vq mostró que en la concentración utilizada acorta el tiempo de formación del coágulo de fibrina (10 veces menor respecto al control); pero dada su alta actividad proteolítica, posteriormente hidroliza los coágulos de fibrina, detectándose una hidrólisis del 80% del coágulo después de 20 minutos de contacto con la preparación Vq. Conclusiones La preparación proteolítica obtenida a partir del látex de V. quercifolia por un lado tiene la capacidad de actuar como un agente coagulante al disminuir el tiempo de coagulación modificando fundamentalmente el APTT, pero también es capaz de hidrolizar coágulos de fibrina. La actividad predominante podría ser seleccionada en función de la concentración y el tiempo de acción. Vq muestra ser una preparación con potencial terapéutico para el desarrollo de medicamentos en el área de la investigación biofarmacéutica.