Los Efectos Hipertroficos y Fibroticos de la Angiotensina II (AII) Son Mediados Por TRH (Hormona Liberadora de Tirotrofina) en el Raton Con Infusion de AII: Confirmacion ?In Vitro?

LUDMILA S PERES DIAZ; MARIANO L SCHUMAN; MAIA AISICOVICH; JORGE E TOBLLI; MARIA S LANDA; SILVIA I GARCÍA

Buenos Aires

Congreso; XXIII Congreso de la Sociedad Argentina de Hipertensión Arterial; 2016

Sociedad Argentina de Hipertensión Arterial-International Society of Hypertension

Hemos demostrados que el sistema de la TRH cardiacoparticipa en el desarrollo de hipertrofia cardiaca (HC) en ratas SHR y que suinhibición previene la (HC)  a pesar de la severa  hipertensión presente sugiriendo laparticipación del tripeptido en este proceso (Schuman 2011). Másaún,  observamos que la sobreexpresión deTRH en el VI, provocada por inyección intracardiaca de un plásmido quesobreexpresa TRH, induce el fenotipo del corazón hipertrofiado en una rataWistar normal induciendo la expresión de marcadores de hipertrofia y fibrosis (Schuman2014). Es conocido que la angiotensina II (AII) además devasopresora es proinflamatoria e induce hipertrofia y fibrosis cardíaca endiferentes modelos animales. En base a estos antecedentes hipotetizamos que laTRH cardíaca podría mediar los efectos hipertróficos y fibróticos de la AII enel miocardio. Con este objetivo de estudio utilizamos ratones C57 adultos a losque se les realizó una  infusión continuade AII (bomba osmotica 2 mg/kg/día) vs. Fisiológica (SF) durante 7d, yevaluamos los daños en dos grupos, uno al que previamente se le inhibió elsistema de TRH a través de una inyección intracardíaca de un siRNA específicocontra el precursor de TRH (siRNA-TRH) vs uno con el sistema de TRH cardíacointacto (siRNA-Con). Registramos diariamente el peso corporal, la presiónarterial sistólica (PAS) y el consumo de agua. Al sacrificio, se extrajo elcorazón y se midió T3 y T4. A partir del RNA total de ventrículo izquierdo (VI)se cuantificó la expresión del mRNA de preTRH, su receptor (r-TRH I), colágenoIII, BMHC, BNP y TGF-B por PCR en tiempo real. Observamos que  la AII aumentó (p< 0.05)  la PAS enambos grupos evidenciando su efectividad, además provocó  un aumento(p< 0.05) de la expresión de TRH cardíaca sólo en el grupo AII+siRNA-Con,verificándose la inducción de TRH por AII y también la efectividad del bloqueodel sistema mediante siRNA-TRH. No hubo cambios en el índice hipertrófico (pesocorazón/peso corporal) probablemente debido a la corta duración delexperimento; aún así, a los 7d, la AII fue capaz de inducir el aumento  (p<0.05) en la expresión de BNP, BMHC,colágeno III y TGF-B en el grupo AII+siRNA-Con, aumento que no se observó en elgrupo con el sistema de la TRH cardiaco bloqueado, grupo que presentó unaexpresión de los marcadores de daño cardíaco similar a los animales con SFsugiriendo que a los 7 dias de infusión, el proceso de hipertrofia cardiacaestaba recién comenzando y la TRH cardíaca participaba en los efectos inducidospor AII.Entendiendo que en este protocolo la ausencia decambios en el índice de hipertrofia podría deberse a la corta duración deltratamiento, decidimos repetir el mismo protocolo extendiendo el tiempo deinfusión de AII al doble del tiempo (14 d), para evidenciar el aumento dehipertrofia a través del índice e investigar si la ausencia de TRH cardíaca podríaatenuarlo.Observamos que la AII aumentó (p< 0.05)  provocó  un aumento (p< 0.05)de la expresión de TRH cardíaca sólo en el grupo AII+siRNA-Con, verificándosela inducción de TRH por AII observada a los 7 días. Pudimos confirmar esteresultado a nivel proteico mediante inmunohistoquimica (p<0.01) observandouna marcada coloración en el grupo AII+siRNA-Con que se vio atenuada en elgrupo con el sistema de la TRH cardiaco inhibido y fue casi indetectable en losgrupos con SF.Como era esperable, la AII nuevamente indujo unaumento (p<0.05) de la PAS y a favor de nuestra hipótesis, encontramos unaumento del índice hipertrófico sólo en el grupo tratado con AII+siRNA-Con,mientras que los animales sometidos a la infusión de AII con el sistema de laTRH bloqueado mostraron un índice hipertrófico similar al grupo con SF(p<0.05) indicando que el bloqueo de TRH atenúa los efectos de AII.A favor de este resultado observamos que, AIIindujo un aumento (p<0.05) de la expresión del mRNA de BNPy BMHC,  enel grupo AII+siRNA-Con, aumento que no se observó en el grupo AII+siRNA-TRHsugiriendo que la TRH estaría participando en la  hipertrofia inducida por AII.En concordancia observamos la inducción (p<0.05)de la expresión del gen de TGFb por parte de la AII que se vio atenuada alinhibir el sistema TRH. Este resultado fue confirmado a nivel proteico porinmunohistoquimica en donde se observa que la proteína es casi indetectable enlos grupos controles, con una inducción de 6 veces con AII que cae a un tercioen el grupo con AII y el sistema de TRH bloqueado (p<0.01). A favor de queTGFB es un factor clave en la inducción de fibrosis mediada por AII, observamosque el octapéptido indujo un aumento (p<0.05) de la expresión del mRNA de colágenoIII  en el grupo AII+siRNA-Con, aumento que no se observó en el grupoAII+siRNA-TRH, este resultado es coincidente con la tinción de Sirius red  y de Tricromico de mason en las cuales sepudo observar que hay una intensa coloración (roja y azul respectivamente) enel grupo tratado con AII con el sistema TRH intacto mientras que el grupo conel sistema inhibido la señal disminuyó (p<0.01) al 50 % aproximadamente  evidenciando la participación del tripeptidoen el proceso fibrotico inducido por AII.   Tratando de dilucidar si la acción de AII sobre TRHse daba en forma directa es que utilizamos el cultivo de células y teniendo encuenta que el fibroblasto posee el sistema de TRH y es responsables de la fibrosisa través de la expresión de colágenos y la consecuente expansión de la MEC,  crucial en esta patología utilizamos la línea celular de fibroblastos de ratón NIH3T3. En este ensayo, estimulamos los cultivos por 24h con AII (1uM) ( n=7 por grupo) a los que previamente les inhibimos elsistema de TRH, mediante la transfeccion de un  siRNA especifico contra el precursor de TRH(siRNA-TRH), comparándolos con células con el sistema de TRH intacto(siRNA-Con). La transfección se realizó 36 hs previo al estimulo utilizandolipofectamina 2000. A las 24 hs post estímulo con AII, los cultivos fueronlevantados y a partir del RNA total se cuantificó la expresión del mRNA depreTRH, colágeno III, colágeno I, TGF-B y BNP por PCR en tiempo real. A favorde nuestra hipótesis, observamos que la AII aumentó (p<0.03) la expresión deTRH. Este aumento solo se evidenció en el grupo de AII+siRNA-Con con el sistemade TRH activo confirmando además que la maniobra del bloqueo fue efectiva. Laacción de AII sólo indujo la expresión de colágeno III, TGF-B y BNP  en el grupo que presentó  aumento de TRH demostrando que en necesarioel sistema de TRH en  los efectos de laAII. Por último, decidimos estudiar si la inducción de TRH vía AII involucrabaal receptor AT1 y para evaluarlo bloqueamos el receptor AT1 con un antagonistaespecífico (losartan 10 uM) durante 3 hs antes del agregado de  AII en dosis de 1 y 10 uM durante 24 hs enmedio libre de suero definiendo 6 grupos (n=7): 1=Agua, 2=AII 1uM, 3=AII 10 uM,4=agua+losartan, 5=AII 1uM+lossartan, 6=AII10uM+losartan. Como esperábamos, laAII indujo un aumento de TGF-B (p<0.01), aumento que fue completamente bloqueadocon el agregado de losartan (p< 0.01) evidenciando la efectividad deltratamiento y la de su bloqueante. Al evaluar la expresión de TRH observamos unmarcado aumento en el grupo estimulado con AII 10 uM que se vió atenuadosignificativamente con el agregado previo de losartan. Asi podemos proponer quela TRH podría actuar como mediador de los efectos fibróticos de la AII inducidos a través de su receptor AT1.  Entendiendo que enel corazón los fibroblastos interactúan con los miocitos  e intercambian señales que luego integran eltejido cardiaco en su conjunto, abordamos también el estudio en cultivo celularde la línea H9C2 (miocitos de rata) en la que primeramente quisimos evaluar elefecto del estimulo con AII sobre la expresión de TRH. Repitiendo el modelo deestimulación con AII y el bloqueo de TRH por transfección del siRNA mediantelipofectamina, observamos que la acción de AII sólo indujo significativamentela expresión del gen de TRH en el grupo con AII con el sistema de TRH intactono evidenciándose este aumento en el grupo que tenía el sistema de TRHbloqueado confirmando la efectividad de la maniobra de bloqueo. Este resultadofue confirmado a nivel proteico mediante la técnica de inmunofluorescencia(p<0.01). A favor del efecto hipertrófico en estas células observamos que laAII indujo un aumento significativo (p<0.05) en la expresión del genmarcador de hipertrofia BNP que no fue observado en el grupo que recibió AII ytenía el sistema de la TRH previamente bloqueado por siRNA.El conjunto de resultados tanto ?in vivo? como ?invitro? en ambos tipos celulares fibroblastos y miocitos nos permiten ubicar ala TRH como uno de los mediadores de los efectos fibróticos e hipertróficos queejerce a través de los receptores AT1 en roedores, nunca antes descripto.