CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y BIOQUÍMICA DE LACASAS PROCEDENTES DE BASIDIOMICETES

ZAPATA, PEDRO DARÍO

Buenos Aires

Conferencia; XIII Congreso Argentino de Micología 2014; 2014

Asociación Argentina de Micologia

Los basidiomicetes presentan una amplia capacidad degradativa, produciendo como parte de su metabolismo un amplio espectro de enzimas oxidativas con capacidad de liberar productos monoméricos de la lignina y otros compuestos policíclicos. Entre las enzimas más estudiadas se encuentra la lacasa, una fenoloxidasa sustrato no específico que utiliza oxígeno molecular para realizar su catálisis. Esta baja especificidad de sustrato la hace atractiva para ser aplicada en procesos biotecnológicos como producción de biocombustibles, biorremediación y biopulpado. Nuestro grupo ha seleccionado y comenzado a estudiar estos sistemas enzimáticos con miras a seleccionar lacasas que muestren propiedades particulares y permitan alcanzar sistemas de producción que favorezcan su aplicación en algunos bioprocesos, como la producción de bioetanol de 2º y 3º generación (etapa de pretratamiento), la biorremediación (tratamiento de efluentes de la industria de la celulosa y el papel, y tratamiento de PCB en suelos contaminados), el biopulpado y bioblanqueo de pastas celulósicasdestinadas a papel, y la producción de alimentos (eliminación de polifenoles que causen sabor amargo).Para esto deben analizarse tanto las características bioquímicas como genéticas de estas enzimas de modo de poder seleccionar las más prometedoras. Como primer paso se examinó el potencial oxidativo de hongos filamentosos mediante ensayos cualitativos y se seleccionaron 5 cepas que mostraron mayor actividad ligninolítica y específicamente de lacasas. Posteriormente se estudiaron las curvas de crecimiento y secreción de lacasas. A través del estudio de isoenzimas se identificaron las isoformas presenten en cada condición y las predominantes, analizándose los posibles inductores para una posterior verificación. El ajuste de las condiciones óptimas de cultivo permitió purificar las enzimas y realizarle estudios cinéticos y bioquímicos. Estas mismas condiciones permitieron obtener enzima suficiente para iniciar estudios de prospección biotecnológica aplicándolas a diferentes bioprocesos. De las lacasas caracterizadas, las procedentes de Phlebia brevispora BAFC 633 muestran una especial sensibilidad al cobre y al pH, siendo inducida por siringaldehído, siringol, guayacol, ácido sinápico, vainillina, ácido ferúlico y CuSO4. La secuencia génica identificada muestra un 63-73% de identidad con lacasas, he incluyen 13 exones y 12 intrones, que codificaría una proteína madura de 506 aminoácidos. Posee todas las regiones conservadas de unión al cobre. Además por análisis de mRNA se ha demostrado que el CuSO4 actúa a nivel de la expresión génica. Las enzimas caracterizadas muestran pesos moleculares de 60 y 75 kDa y son estables por períodos largos, con una vida media cercana a las 25 h. Finalmente,se estudiaron variables que afectaron la actividad enzimática en el extracto crudo, indicando la conveniencia del biopulpado a 30°C por favorecer la estabilidad enzimática y la remoción de la lignina selectivamente durante el biotratamiento de chips, generando una estructura más abierta y de mejor acceso al licor de pulpado.