Puesta a punto de la expresión de proteínas recombinantes del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) de interés diagnóstico.

ENRIQUE, RAMÓN; GIRI, ADRIANA; GARCÍA VÉSCOVI, ELEONORA; ZELUS, DOMINIQUE; SONCINI, FERNANDO; SERRA, ESTEBAN

Buenos Aires

Congreso; VIII Congreso Argentino de Virología; 2005

Sociedad Argentina de Virología

La producción de proteínas virales antigénicas por tecnología de ADN recombinante ha permitido a la industria diagnóstica generar sistemas de detección tipo ELISA de alta sensibilidad y especificidad. De particular interés por el impacto sanitario y comercial, es el uso de sistemas ELISA para el dosaje de anticuerpos anti-VIH en los individuos expuestos a la infección. Los ensayos que se utilizan para tal fin usan una mezcla de antígenos recombinantes diseñados a partir de distintas proteínas virales como substrato antigénico, que en general son de orígen importado. Además, la generación de antígenos virales por técnicas recombinantes se ve afectado por la díficil solubilización de los mismos que condicionan su inmunogenicidad. Con el objetivo de sustituir importaciones en la industria nacional, en el presente trabajo se describe la obtención de proteínas recombinantes del VIH y su purificación por métodos desnaturalizantes y no desnaturalizantes. Se diseñaron oligonucleótidos que permiten la amplificación de regiones altamente inmunogénicas de los genes env de VIH tipo 1 y de VIH tipo 2. Dichas regiones fueron amplificadas por PCR y los productos resultantes fueron subclonados en vectores de expresión. Se obtuvieron proteínas recombinantes correspondientes a fragmentos de gp120, gp41, gp36 y a una proteína quimera conteniendo fragmentos de gp120 y gp36 en un mismo polipéptido. Todos los polipéptidos fueron recuperados como cuerpos de inclusión. Los mismos fueron lavados con concentraciones bajas de urea y posteriormente disueltos en una solución de pH controlado conteniendo urea 8 M. Las proteínas disueltas fueron unidas a una columna de Ni-NTA-agarosa y luego renaturalizadas en la columna mediante lavados con soluciones de concentración decreciente de urea. Los bajos rendimientos de proteína soluble obtenidos mediante este método desnaturalizante impidieron realizar ensayos de antigenicidad. Para la purificación de los antígenos en forma no desnaturalizante, se ensayaron detergentes zwitteriónicos en distintas concentraciones. En las condiciones seleccionadas, las proteínas disueltas en detergente pudieron ser unidas a una columna de Ni-NTA-agarosa y eluídas en presencia de imidazol. Conclusión: En el presente trabajo se clonaron y expresaron las regiones más inmunodominantes de los genes env del VIH tipo 1 y 2, y se probaron 2 métodos de purificación de las proteínas resultantes. Con el método no desnaturalizante el rendimiento global del proceso de purificación fue del 20%, y los antígenos obtenidos resultaron solubles y estables en el tiempo. El éxito de esta estrategia a escala de laboratorio permitirá el posterior escalado del procedimiento para su uso con fines diagnósticos.