ESTUDIO PRELIMINAR DEL DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE ESPECIES DE CRYPTOSPORIDIUM EN LAGARTOS GECKO LEOPARDO (Eublepharis macularius)

DELLARUPE A.; UNZAGA J.M.; KIENAST M.; LARSEN A.; BACIGALUPE D.; MORÉ G.; STIEBEL C.; BASSO W.; VENTURINI M.C.; VENTURINI L.

Santa Fe

Congreso; XVII Reunión Científica Técnica AAVLD; 2008

Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorio de Diagnóstico

  Introducción La Cryptosporidiosis es una zoonosis de amplia distribución mundial que afecta tanto a mamíferos como animales de sangre fría. En los seres humanos suele ocasionar diarreas principalmente en niños y pacientes inmunodeprimidos. La cryptosporidiosis es común en animales de sangre fría y ha sido reportada en al menos 57 especies de reptiles. A diferencia de lo que ocurre en otros animales inmunocompetentes en donde la cryptosporidiosis es usualmente autolimitante, en reptiles es frecuentemente crónica y algunas veces suele ocasionar la muerte. Varias especies de Cryptosporidium han sido reconocidas en lagartos, principalmente C. serpentis y C. saurophilum.En los últimos años la cryptosporidiosis ha afectado económicamente a los criadores comerciales de lagartos geckos. Materiales y métodos Se recolectó materia fecal diarreica de tres lagartos gecko leopardo (Eublepharis macularius) de cría en cautiverio. Se detectó la presencia de ooquistes de Cryptosporidium sp. mediante la técnica de Ziehl-Neelsen modificada. La muestra fue dividida en dos submuestras: una fue sometida a concentración por la técnica de Ritchie modificada, permaneciendo la segunda sin tratamiento. Para la extracción de ADN se utilizó un kit comercial DNA stool mini kit según recomendaciones de los fabricantes. Para la amplificación del fragmento de 830bp del gen 18S rRNA se usaron los primers correspondientes. Para la PCR primaria se realizó el Master mix conteniendo 1x PCR buffer, 3 mM Mg Cl2, 0,2 mM dNTP, 2,5 U Taq, 2,5 ul BSA ( 0.1g/10ml) y 1 uM de cada uno de los primers para la primera ronda en un volumen de 50 ul. Cada uno de los 35 ciclos consistió en 94ºC 45s, 59ºC 45s y 72ºC 1minuto, , comenzando a 94ºC durante 3 minutos y finalizando a 72ºC durante 7 minutos. Para la PCR secundaria se siguió el mismo protocolo excepto que la concentración de Mg Cl2 fue de 1,5 mM. Cada uno de lo 40 ciclos consistió en 94ºC 30s, 58ºC 90s y 72ºC durante 2 minutos, comenzando con 94ºC durante 3 minutos  y finalizando con 72ºC durante 7 minutos. El producto de la PCR secundaria fue analizado en gel de agarosa al 1% en buffer TAE y teñido mediante bromuro de etidio. Agua fue utilizada como control negativo. Resultados La “nested” PCR para la detección de Cryptosporidium sp. en  materia fecal de lagartos gecko leopardo (Eublepharis macularius) fue positiva en ambas submuestras. Discusión La “nested” PCR positiva para la detección del gen 18S rRNA confirma la presencia del parásito en  materia fecal. No se justifica la realización de un tratamiento previo a la extracción de ADN de Cryptosporidium en muestras positivas. En una segunda etapa se realizará la secuenciación del fragmento de 830bp del gen 18S rRNA para la identificación de especies   de Cryptosporidium en lagartos gecko leopardo (Eublepharius macularius)