Estrategia de ARN doble cadena para generar resistencia simultánea a los virus PLRV y PVY en plantas transgénicas

A. SUYAMA, M.E. SEGRETIN, M. RIVERO, A. MENTABERY Y F.F. BRAVO-ALMONACID

Buenos Aires, Argentina

Congreso; V° Simposio Argentino de Biotecnología Vegetal; 2002

Redbio

La obtención de plantas transgénicas que expresan secuencias virales traducibles o no, ha permitido la selección de plantas resistentes a estos patógenos. El mecanismo involucrado, silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS), ha sido motivo de intensa inves­tigación en los últimos años permitiendo el desarrollo de construcciones optimiza­das para activarlo en las plantas transgé­nicas. Así se ha demostrado que la fre­cuencia y eficiencia de PTGS son mayo­res cuando la construcción introducida produce ARN doble cadena a partir de secuencias complementarias separadas por un intrón (Wesley y col, 2001). Sobre la base de estas evidencias diseñamos dos cons­trucciones, pCASH y pCRASH, para ob­tener plantas de Solanum tuberosum re­sistentes a los virus PVY y PVY/PLRV respectivamente (principales patógenos virales de cultivos de papa en Argentina). Para verificar la inducción de PTGS en las plantas transformadas, se diseñaron construcciones con secuencias de PVY y PLRV fusionadas al gen repor­tero b-glucuronidasa interrumpido por un intrón (pGUSiPVY y pGUSiPLRV). Éstos plás­midos binarios serán utilizados en expe­rimentos de expresión transitoria (agroin­filtración) para seleccionar, me­diante el análisis de la expresión del gen indicador, aquellas plantas en las que se halla desen­cadenado el silenciamiento. Metodología: Las construcciones se ob­tuvieron utilizando métodos clásicos. pCASH, pCRASH, pGUSiPVY y        pGUSiPLRV fueron realizadas en el vec­tor binario pPZP200-BASTA. Transformación vegetal:  mini tubércu­los de Solanum tuberosum var. Spunta y dis­cos foliares de Nicotiana tabacum var. Samsung fueron transformados utilizando  Agrobacterium tumefaciens (GV3101) y el herbicida BASTA (al 1,5%) como agente selector. Agroinfiltración: para la puesta a punto se trabajó con plantas jóvenes de N. Tabacum Xhanti D8 que fueron agroinfil­tradas con A.tumefaciens cepa GV3101 (culti­vadas en condiciones de inducción de los genes vir, según Van der Hoorn y col., 2000). Se utiliza­ron las cons­trucciones pGUSiPVY, pGUSiPLRV y p35SGUSi (como control). A la semana se evaluó la actividad  b-glucuronidasa en discos de hojas de las zonas infiltradas.