Estudio Supramolecular del fragmento 33-mer de la proteína alfa-2 gliadina en solución

HERRERA. M.G; SEWALD. N.; DODERO.V.I

Congreso; Cuarto Congreso Argentino de Materia Blanda (MAB IV); 2012

El fragmento 33-mer, cuya secuencia es LQLQPF(PQPQLPY)3PQPQPF, es producto de la digestión enzimática parcial de la proteína α2-gliadina, encontrada en cereales tales como el trigo avena, centeno y cebada. Este péptido rico en prolina es capaz de inducir una respuesta inmune en individuos susceptibles, asociándose con la sensibilidad al gluten y la enfermedad celíaca. Esta patología es debida a una desregulación en la respuesta tanto innata como adaptativa del sistema inmune, cuando el organismo se enfrenta a este péptido. Como consecuencia de ello se desarrolla un síndrome de carácter autoinmune, que no solamente afecta al intestino, sino que es capaz de generar daño en otros órganos. Para que se produzcan estas manifestaciones, el péptido debe ser capaz de llegar y luego atravesar la mucosa intestinal, ya sea por vía paracelular o transcelular. Se ha hipotetizado que un incremento de la permeabilidad intestinal es uno de los primeros eventos en la patogénesis de la enfermedad celíaca, pero no se ha logrado establecer cuáles son las características que hace que la proteína gliadina, y en especial el péptido 33-mer actúe como su desencadenante de esta patología. (1-5). Considerando lo expuesto anteriormente, se decidió evaluar el comportamiento supramolecular de este péptido en solución acuosa a través de Dicroísmo circular (DC) y estudios de espectroscopia UV-Vis a distintas concentraciones y temperaturas. METODOLOGÍA 1) Síntesis del fragmento 57-: El péptido fue obtenido a través de síntesis en fase sólida utilizando una metodología clásica Fmoc/tBut y purificado por RP-HPLC. Su identidad se corroboró por espectrometría de masas ESI y Maldi-Tof. 2) Evaluación Supramolecular en solución: Dicroísmo circular: Se realizaron espectros del péptido a distintas concentraciones, en soluciones acuosas a pH 7.0. Se utilizó un espectrómetro CD Jasco J 810 usando un sistema de Peltier para el control de la temperatura. En cada medición, se adquirieron 3 scanns en el rango de 190-250nm a la temperatura seleccionada. Espectroscopia UV-Vis: Los espectros UV-Vis se realizaron a distintas concentraciones para calcular la constante de agregación crítica (c.a.c). Se seleccionaron las concentraciones 100µM y 600µM para realizar rampas de temperaturas desde 0°C a 90°C y estudiar el perfil de desnaturalización del sistema. Para ello se utilizó un espectrofotómetro modelo V-630 BIO acoplado a un sistema de termostatización peltier con un holder para una sola celda. En este caso se usaron rampas de 1°C/min y la temperatura seleccionada se mantiene en +/-0.10°C por 10s. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se realizaron estudios de DC debido a que es una técnica sensible para determinar estructura secundaria bajo diferentes condiciones experimentales, como temperatura, pH y fuerza iónica (6) Se observó que el péptido 33-mer se autoorganiza dependiendo de la concentración. A concentraciones menores a 60 μM , se encuentra totalmente desordenado (random coil). En el rango de 80-200 μM hay un incremento en la rigidez del sistema, observándose un equilibrio conformacional random coil-PPII dependiente de la temperatura. Aumentando la concentración en el rango 200-600 μM, se observó un desplazamiento batocrómico de la banda de absorción mínima observándose así como también un equilibrio conformacional de dos estructuras extendidas como son PPII- beta-plegada en función de la temperatura. El desplazamiento batocrómico de las bandas de absorción así como la disminución del contenido helicoidal, es característico de un sistema que se está autoorganizando .(7)Se realizaron estudios UV-Vis seleccionando como longitud de onda de trabajo 276 nm, característica de los aminoácidos tirosina. Se llevó a cabo medidas en un rango de concentraciones de 10-600 µM, a 25°C, obteniendo un valor de concentración de agregación crítica (c.a.c) de 187µM. Este valor es similar al obtenido por experimentos de DC, el cual se encuentra en 197 µM, por lo cual ambos datos confirman un proceso de autoagregación y organización estructural a partir 200µM. Experimentos a diferentes temperaturas evidenciaron la capacidad de 33-mer de plegarse en una estructura PPII a baja temperatura en todo el rango de concentraciones. Mientras que solo a 600 μM, se observó una estructura típica de hoja beta a 37°C, lo cual podría ser biológicamente relevante. Otra evidencia de la existencia de agregados solubles, se obtuvo a partir de experimentos de variación de temperatura a dos concentraciones definidas, por debajo y por encima del valor de c.a.c hallado. A 100 µM se observaron varias transiciones a distintas temperaturas ;mientras que a 600µM, se obtiene una curva con un comportamiento lineal donde existen pequeños cambios de absorbancia a 3,70°C y a 74°C . Como puede observarse los perfiles de desnaturalización a estas concentraciones son significativamente diferentes. CONCLUSIONES En función de los resultados obtenidos mediante espectroscopia DC y UV-Vis, podemos concluir que el péptido 33-mer de la proteína alfa-2-gliadina es capaz de autoagregarse en función de la concentración y que dicha autoagregación conlleva un proceso de plegamiento desde una estructura desordenada a PPII y luego a hoja beta-plegada. REFERENCIAS 1- 1. Shan, L., Qiao, L.S., Arentz-Hansen, H., Molberg, Ø., Gray, G.M., Sollid, L.M. and Khosla, C., Identification and analysis of multivalent proteolytically resistant peptides from gluten: implications for celiac sprue , J. Proteome. Res., 4, 1732-1741 (2005)2. Shan, L., Molberg, Ø., Parrot, I., Hausch, F., Filiz, F, Gray, G.M., Sollid, L. M. and Khosla, C., Structural basis for gluten intolerance in Celiac Sprue, Science, 297, 2275-2279 (2002). 3. Hadjivassiliou, M., Williamson, C.A., and Woodroofe, N., The immunology of gluten sensitivity: beyond the gut, Trends Immunol. 25, 578-582(2004)4. - Rubio-Tapia, A. and Murray, J. A., Celiac Disease. Curr. Opin. Gastroenterol. , 26, 116-122 (2010).5. Fassano, A. and Shea-Donohue, T., Mechanisms of Disease: the role of intestinal barrier function in the pathogenesis of gastrointestinal autoimmune diseases, Nat. Clin. Pract. Gastroenterol. & Hepatol.2, 416-422 (2005).6. Dodero, V.I., Quirolo, Z.B., Sequeira, M.A., Biomolecular Studies by Circular Dichroism, Frontiers in Bioscience 16, 61-73 (2011).3- 4-. 5 6- 7-7. Aggeli, A., Nyrkova, I. A., Bell, M.R., Harding, L., Carrick, T., McLeish, C.B., Semenov, A.N., and Boden, N., Hierarchical self-assembly of chiral rod-like molecules as a model for peptide b-sheet tapes, ribbons, fibrils, and fibers, Proc. Natl. Ac. Sci., 98, 11857-11862 (2001) 2-