Evaluación del fragmento 56-88 de la proteína alfa-2 gliaidna sobre superficies biomiméticas.

HERRERA. M.G; DODERO.V.I; SCHILARDI. P.L; SEWALD. N.; SALVAREZZA. R. C.; HÜTTEN. A.; MIL. N; ROTT. K

Congreso; Cuarto Congreso de Argentino de Materia Blanda (MAB IV); 2012

Las gliadinas son una familia de proteínas que se encuentran en cereales como el trigo, avena, centeno y cebada, formando parte de lo que se conoce como gluten. Entre ellas se encuentra la alfa2-gliadina la cual no es degradada totalmente a nivel intestinal generando, una serie de péptidos, entre ellos el 33-mer (1,2).El fragmento 33-mer es considerado uno de los péptidos inmunogénicos capaces de derivar una respuesta autoinmune con manifestaciones intestinales y extra-intestinales, en individuos susceptibles y genéticamente predispuesto como son la sensibilidad al gluten y enfermedad celíaca. Este péptido ha demostrado poseer capacidad de atravesar la mucosa intestinal mediante transitocis, de aumentar las uniones estrechas entre las células epiteliales del intestino, favoreciendo un aumento de la permeabilidad de la mucosa intestinal, los cuales se saben son factores que contribuyen a la patogénesis de la enfermedad celíaca. (3-6). Teniendo en cuenta la capacidad de este péptido de llegar intacto a la membrana basal de las células epiteliales intestinales e interaccionar con ellas decidimos evaluar su interacción con una superficie biomimética como el silicio y su dióxido, debido principalmente a que presenta valores de hidorfobicidad similares a los de la mucosa intestinal, en particular el duodeno.(7). La capacidad de interacción superficial fue realizada a través de microscopía electrónica (TEM, STEM y SEM) y microscopía de fuerza atómica (AFM) en modo tapping. METODOLOGÍA 1) Síntesis del fragmento 56-88-: El péptido fue obtenido a través de síntesis en fase solida utilizando una metodología clásica Fmoc/tBut y purificado por RP-HPLC. Su identidad se corroboró por espectrometría de masas ESI y Maldi-Tof. 2) Estudio de la Autoagregación: Para evaluar la capacidad de autoensamblaje sobre superficies de hidrofilicidad intermedia, se llevó a cabo observaciones de microscopia electrónica sobre grids y wafer de SiO2 y de fuerza atómica sobre wafer de silicio. Procedimiento: Se colocó una alícuota del péptido en agua sobre, los grids y superficies, se dejó interactuar, retirando el exceso y se procedió a la observación. Los equipos utilizados fueron: TEM: microscopio electrónico Philips CM 100 con un haz de 80kV. STEM y SEM: microscopio LEO Gemini 1530 con un haz de electrones de 20kV. AFM: equipo Nanoscope V, marca Veeco, en modo tapping con una punta RTESP y usando un scanner J. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En las microscopias de STEM y de TEM se usó un grid de Cu recubierto de SiO2, este recubrimiento transparentes a los electrones provee un muy bajo ruido de permitiendo lograr una resolución nanométrica, sin la necesidad de utilizan contrastes químicos tales como el acetato de uranilo. Esto representa una ventaja, ya que posibilita observar a los especímenes biológicos directamente. En estas condiciones se observó la presencia de estructuras esféricas, las mismas poseen diámetros que rondan entre los 1 a 2 μm . Además se observó la formación de estructuras amorfas densas, difíciles de caracterizar mediante TEM y STEM. Se realizaron SEMs, sobre superficies de SiO2 usando una metalización con tantalio. Este metal permite lograr mejores resoluciones, ya que la capa de metal depositada sobre el espécimen es de solo 1nm,permitiendo así una mejor caracterización de la topografía del sistema. En este caso se observó la presencia de esferas de distinto diámetro, unas de aproximadamente 10-15 μm y otras de 1-2μm . Estas parecen asociarse para dar lugar a una estructura compacta, similar a la de un hidrogel, en el cual las esferas se disponen en distintas capas. A través de un proceso de congelado y secado ultra-rápido, fue posible detener el proceso de autoagregación superficial y así detectar nanoesferas pequeñas de entre 10-50nm de diámetro y agregados más grandes compuestos de estas nanoesferas En base a los resultados encontrados anteriormente, se decidió evaluar estos agregados mediante AFM. Esta técnica fue elegida ya que permite caracterizar topográficamente a los sistemas sin la necesidad de metalizar. Mediante el uso del modo tapping se puede analizar muestras biológicas, que podrían distorsionarse usando otra forma de adquisición de los datos. A través de esta metodología se observó la presencia de esferas de 1,5-2 μm de diámetro y de estructuras de forma de placas tipo hidrogel en cuyo interior hay fibras de 500nm de diámetro. CONCLUSIONES A través de una combinación de técnicas nanoscópicas, se evaluó la capacidad de agregación del péptido 33-mer de la proteína alfa2- gliadina sobre superficies de hidrofobicidad moderada. Es interesante considerar que estos datos fueron obtenidos mediante mediciones de ángulo de contacto, presentando estas superficies valores de 43° y 48°, los cuales son similares a los determinados para el duodeno. (7). Teniendo en cuenta los diferentes tamaños de las esferas, es posible plantear un proceso de autoagregación iniciado por la formación de micelas (10-50 nm), vesículas (1-2μm) y finalmente un hidrogel, formado por la coalescencia de las esferas. Las fuerzas de cohesión del hidrogel son débiles, ya este proceso es reversible por lo que hipotetizamos, pueden ser debidas a interacciones no-covalentes entre cadenas y el agua circundante. En estos momentos estamos evaluando las características reológicas del sistema. Referencias: (1). Shan, L., Molberg, Ø., Parrot, I., Hausch, F., Filiz, F, Gray, G.M., Sollid, L. M. and Khosla, C., Structural basis for gluten intolerance in Celiac Sprue, Science, 297, 2275-2279 (2002).-(2). Shan, L., Qiao, L.S., Arentz-Hansen, H., Molberg, Ø., Gray, G.M., Sollid, L.M. and Khosla, C., Identification and analysis of multivalent proteolytically resistant peptides from gluten: implications for celiac sprue , J. Proteome. Res., 4, 1732-1741 (2005)(3). Hadjivassiliou, M., Williamson, C.A., and Woodroofe, N., The immunology of gluten sensitivity: beyond the gut, Trends Immunol. 25, 578-582(2004)(4). Hadjivassiliou, M., Williamson, C.A., and Woodroofe, N., The immunology of gluten sensitivity: beyond the gut, Trends Immunol. 25, 578-582(2004(5). Rubio-Tapia, A. and Murray, J. A., Celiac Disease, Curr. Opin. Gastroenterol. , 26, 116-122 (2010).(6). Fassano, A. and Shea-Donohue, T., Mechanisms of Disease: the role of intestinal barrier function in the pathogenesis of gastrointestinal autoimmune diseases, Nat. Clin. Pract. Gastroenterol. & Hepatol., 2, 416-422 (2005)(7). Qin, X., Caputo, F.J., Xu, D.Z., and Deitch, E-A., Hydrophobicity of mucosal surface and its relationship to gut barrier function, Shock, 29-3, 372-376 (2008).