Mapeo de los residuos involucrados en la interacción con la ARN polimerasa L dentro de la región definida entre los aminoácidos G36 y R85 de la proteína Z del Virus Tacaribe

LOUREIRO ME; WILDA M; LÓPEZ N

Buenos Aires

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología; 2008

Sociedad Argentina de Virología

El virus Tacaribe (VTac), prototipo de los arenavirus del Nuevo Mundo, comprende un único grupo filogenético junto con los virus patógenos sudamericanos productores de fiebres hemorrágicas. El genoma de VTac codifica para cuatro proteínas: el precursor de las glicoproteínas (GPC), la proteína de la nucleocápside N, la proteína L y una pequeña proteína Z (95 aa). En esta última proteína se identifican tres regiones: la región N-terminal (residuos 1-39), un motivo RING-finger (aa 40-76) y una región C-terminal con 19 aa (residuos 77-95). Utilizando un sistema de genética reversa que reconstruye la transcripción y la replicación del ARN, basado en el suministro de los ARN y proteínas de VTac por medio de plásmidos recombinantes, hemos demostrado que las proteínas N y L son suficientes para que se lleve a cabo la transcripción y replicación de los ARN genómico y antigenómico, para una correcta iniciación de ambos procesos y para una correcta terminación de la transcripción de los ARNm. Usando ese sistema, además, demostramos que tanto la proteína Z en su forma salvaje como la proteína de fusión de Z con la glutation-S-transferasa (gst) (gstZ), inhiben la transcripción y replicación por interacción directa con la ARN polimerasa L. Mas aun, encontramos que la región comprendida entre los residuos G36 y R95 de Z, es esencial para la interacción con L (J. Virol. 77, 10383-10393 (2003). Estudios posteriores utilizando un péptido de 49 aa, que comprende los residuos G36 a R85, fusionado a gst (gstZ36-85), demostraron que éste conserva la misma capacidad que la Z salvaje para interactuar con L e inhibir su actividad. En este trabajo, hemos comenzado la identificación dentro de la región G36-R85 de los aa involucrados en la interacción con L y en la capacidad de Z de inhibir la actividad de la polimerasa viral. Para esto se  realizaron mutaciones dentro de esta región tanto en gstZ como en gstZ36-85,  dirigidas a aa conservados en todos los arenavirus. Dentro del dominio RING se mutagenizaron los residuos W44,  L50 e Y57. Por otro lado, Para definir la participación de los residuos presentes en los extremos N- y C-terminal adyacentes aL dominio RING, se generaron mutantes puntuales de los residuos R37, Y38, N39 y una mutante por deleción que comprende los aa G36 a P81. La interacción entre gstZ, gstZ36-85 o las diferentes mutantes y L se estudió mediante ensayos de coinmunoprecipitación con sueros específicos contra L y gst. Se analizó también la capacidad relativa de las mutantes de inhibir la actividad de la polimerasa en el contexto del sistema de genética reversa. Los resultados obtenidos señalan a los aa R37, Y38 y N39 en la región N-terminal y los aa W44 y L50, dentro del dominio RING, como determinantes en la interacción entre Z y L.