Estudios sobre células de adenocarcinoma de pulmón humano sensibles y resistentes a terapia fotodinámica

FUKUDA H,; TEIJO MJ,; BATLLE A

CABA

Congreso; 15º CONGRESO MEDICINA INTERNA HOSPITAL de CLINICAS José de San Martin; 2014

HOSPITAL de CLINICAS José de San Martin

ESTUDIOS SOBRE CÉLULAS DE ADENOCARCINOMA DE PULMÓN HUMANO SENSIBLES Y RESISTENTES A TERAPIA FOTODINAMICA Introducción. Terapia fotodinámica (TFD): procedimiento terapéutico para tumores que involucra la administración de un fotosensibilizante (FS) seguido de irradiación con luz de longitud de onda adecuada. En presencia de oxígeno, una serie de reacciones fotoquímicas llevan a la muerte de las células tumorales. La administración de ácido 5-aminolevúlico (ALA), precursor biológico de la síntesis de porfirinas, produce la acumulación de protoporfirina IX (PpIX), un FS endógeno. En la erradicación de tumores mediante TFD pueden intervenir diferentes procesos de muerte celular. Objetivos: Estudiar los posibles mecanismos por los cuales células de adenocarcinoma de pulmón humano son resistentes a la TFD utilizando ALA como generador del agente fotosensible. Materiales y Metodos: Células de adenocarcinoma de pulmón humano (NSCLC) A549 cultivadas 48 h en MEM + SFB 5%, glutamina 1mM y gentamicina 0,16 mg/ml. TFD: A las 48 h de crecimiento, se reemplazó el medio y se incubó 3h con ALA 1 mM, luego se irradió con 2 tubos fluorescentes (18 W, 2 -20 min) y a la hora se determinó viabilidad celular (MTT). Porfirinas: Se extrajeron con HCl 5% y se cuantificaron espectrofluorométricamente (ƛ exc: 406 nm; ƛ em: 604 nm). Apoptosis: por marcación con Annexin-V FITC/Ioduro de propidio, 1 h post-TFD, y citómetria de flujo. Detección de oxígeno singulete: con metoxivinilpireno (MVP) 10 μM y citómetria (λ exc: 485 nm; λ em: 530 nm). Despolarización mitocondrial: 1 h post-TFD, con Rh 123 10 mM y análisis por citometría de flujo (λ exc 511 nm; λ em 534 nm). Resultados y conclusiones:*Alternando ciclos de irradiación y recuperación se obtuvo una población celular resistente a TFD-ALA (C-12), que acumula menos porfirinas: esto podria ser un factor de selección al aplicar los ciclos de TFD. * LA TFD con PpIX en células C-12 produjo recuperación parcial de la sensibilidad a TFD: pueden existir otros mecanismos de resistencia además de la menor acumulación de porfirinas. * Las células C-12 no difieren en la morfología general de las células sensibles (C-S). A nivel subcelular, respondieron a la TFD-ALA conservando un citoplasma homogéneo. En cambio las C-S mostraron gran desorganización de estructuras citoplasmáticas y abundantes vacuolas (datos NM). * En los ensayos de la herida no hubo diferencias en la migración celular entre las células C-S y C-12. * En las células C-12 no se alteró significativamente la proporción de células viables con la TFD, pero se observó despolarización mitocondrial sin liberación de citocromo c al citoplasma, indicando que esa población de células resistentes es capaz de generar 1O2 en respuesta a la TFD. * No presentaron activación apreciable de caspasa-3 pero sí expresión de proteína antiapoptótica Bcl-2, (concordancia con la menor muerte por apoptosis). Consistente con las vacuolas de doble membrana visualizadas por microscopía electrónica, se vio conversión de LC3-II, indicando un proceso autofágico. * Se detectó el factor NFkB en la fracción nuclear de células C-12 post-TFD-ALA y en el control no tratado. En las células C-S, este factor se observó solo con la dosis más leve de TFD. El patrón de localización nuclear de NFkB se correspondió con los niveles citoplasmáticos de su inhibidor IkB. Los resultados sugieren que la activación de este factor, asociado a supervivencia, está relacionado con un efecto a largo plazo de la TFD, dado que las células que reciben un único tratamiento FD sólo activan esta respuesta con dosis subletales, menores a la DL50. *Este comportamiento se verificó parcialmente al incubar las células con inhibidores de la traslocación nuclear de NFkB. En las células C-S, la presencia del inhibidor no disminuyó los % de viabilidad post TFD, sugiriendo que no tendría participación en la supervivencia al tratamiento. En cambio, sí se observó disminución de la supervivencia de células C-12 cuando éstas fueron tratadas con el inhibidor e irradiadas. Estas observaciones apoyan la participación de NFkB en los mecanismos de sobrevida de células resistentes a la TFD.