INMUNOMARCACIÓN ESPECÍFICA CON UNA GAMMAGLOBULINA ANTI-BRUCELLA POR INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA

ESTEIN, S.M.; CACCIATO, C.; ECHEVARRÍA H.M; LUCCHESI E.; SOTO P.

San Miguel de Tucumán

Jornada; XX Reunión de la AAVLD; 2014

AAVLD

INTRODUCCIÓN: La detección directa de Brucella en diferentes muestras clínicas incluye el empleo de las coloraciones de Gram o Ziehl Neelsen modificado por Stamp. Sin embargo, para determinar el género y la especie es necesario el aislamiento de la bacteria por cultivo y posterior identificación a través del empleo de pruebas bioquímicas. La inmunofluorescencia directa (IFD) es una prueba serológica que permite la detección de un antígeno en distintas muestras mediante el empleo de una técnica sencilla, rápida y reproducible. El objetivo de este trabajo fue evaluar la especificidad de la fracción gammaglobulina de un suero policlonal anti-Brucella contra especies del género y bacterias de otros géneros. MATERIALES Y MÉTODOS: Gammaglubulina anti-Brucella: Elaborado para este trabajo por BIOTANDIL (Laboratorio Biológico de Tandil SRL). Preparación de las suspensiones: Se incluyeron en el ensayo cepas lisas (S) (Brucella abortus 544, B. melitensis H38, B. suis 1330) y rugosas (R) del género Brucella (B. canis RM6/66, B. canis M-, B. ovis REO 198). Además, se ensayaron otras bacterias Gram negativas (Actinobacillus seminis, Campylobacter fetus, Escherichia coli, Histophilus somni, Mannheimia haemolytica, Proteus vulgaris) y Gram positivas (Corynebacterium pseudotuberculosis, Staphylococcus aureus, Trueperella pyogenes (ex-Arcanobacterium)). Las bacterias se cultivaron en Agar Sangre Columbia adicionado con un 10 % de sangre bovina. Se prepararon suspensiones de las bacterias inactivadas con solución fisiológica estéril fenolada ajustadas según el tubo 0,5 de la escala de Mac Farland. Técnica de IFD: Se prepararon 10 diluciones del conjugado: 1/25, 1/50, 1/100, 1/150, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500 y 1/600. Por otro lado, cada suspensión bacteriana se montó en un portaobjeto de 12 áreas circulares de 7 mm de diámetro. Cada portaobjetos se secó en estufa a 37°C, fue fijado con etanol y lavado con agua destilada. Cada área fue cubierta con la respectiva dilución del conjugado y posteriormente se incubó en cámara húmeda durante 1 hora (al resguardo de la luz). Se realizaron 3 lavados (10 minutos c/u) con tampón fosfato salino (PBS). Finalmente se lavó con agua destilada y se eliminó el exceso de humedad. Se agregó una gota de glicerina tamponada pH 8 en cada área del portaobjetos colocando un cubreobjetos. La lectura se realizó en un microscopio de fluorescencia con objetivo de inmersión (100X). RESULTADOS: En la siguiente Tabla se presentan los resultados obtenidos en la IFD con las distintas suspensiones bacterianas. El conjugado anti-Brucella reaccionó fuertemente con las cepas de Brucella lisas y en menor grado con las cepas rugosas. No se observaron reacciones significativas con otras bacterias Gram negativas o Gram positivas. Intensidad de la fluorescencia: (+++) reacción fuertemente positiva; (++) reacción positiva; (+ ׀) reacción débilmente positiva; ( ׀) reacción débil; (-) sin reacción. DISCUSIÓN: Los resultados obtenidos indican que la IFD con el conjugado anti-Brucella constituye una técnica sensible y específica que permite, mediante un procedimiento sencillo, la detección rápida de Brucella en extendidos o improntas a partir de muestras de animales sospechosos (Ej: semen, fluido abomasal, macerados placenta) o en colonias de un primer aislamiento. El empleo de esta técnica permitiría tener un resultado rápido teniendo en cuenta que los tiempos de cultivo son extensos y que el aislamiento está sujeto a la viabilidad de la bacteria y al empleo de medios de cultivo selectivos que impiden el crecimiento de contaminantes. BIBLIOGRAFÍA: 1- Ajai CO, Cook JE, Dennis SM. Diagnosing ovine epididymitis by immunofluorescence. Vet Rec. 1980. 107:421-4. 2- Thomas KW, McCausland IP. The use of immunochemically purified anti-Brucella antibody in a direct fluorescent antibody test for Brucella abortus. Vet Immunol Immunopathol. 1980.1:343-52.