SELECCION DE APTAMEROS DE ADN ESPECIFICOS PARA IL-1 BETA HUMANA RECOMBINANTE

CRISTIAN JORGE ALEJANDRO ASENSIO; A. G. VALDIVIESO; T. A. SANTA COLOMA

Mar del Plata

Congreso; SAIC-SAFIS-SAFE 2013; 2013

SAIC

La IL-1β es una citoquina involucrada en numerosas patologías. Existen anticuerpos monoclonales para detectarla o inactivarla, pero no existen aptámeros de ADN. A partir de una librería de ADN de cadena simple con 50 bases aleatorias centrales,se hicieron varias rondas de selección contra IL-1β humana recombinante como blanco. La IL-1β fue adherida a membranas de nitrocelulosa, luego bloqueadas con BSA. En cada ronda los aptámeros unidos a la IL-1β se eluyeron por calor y se amplificaron por PCR. La cantidad de IL-1β se disminuyó a partir de la tercera ronda de 100 a 25 ng. A partir de la cuarta ronda de selección la señal obtenida por PCR fue mucho más alta que la señal de fondo proveniente de la BSA utilizada en el bloqueado o que la señal de un péptido control. Se han implementado nuevas estrategias para hacer las distintas rondas de selección comparables entre si y cuantitativas: el uso de proteínas y péptidos estándares que unen ADN no-específicamente y el uso de cuadrículas diseñadas en computadora e impresas en nitrocelulosa para pegar en ellas proteínas o péptidos en forma ordenada y separada. Los aptámeros se seleccionaron mediante una presión de selección por afinidad y por especificidad. La especificidad se obtuvo mediante la resta de los aptámeros amplificados por unión a BSA depositada en nitrocelulosa (en todas las rondas de selección) y también mediante la resta con lisados de líneas celulares humanas y de S. cerevisiae transferidos a nitrocelulosa (Western Blots). La unión de los aptámeros se monitoreó y cuantificó mediante PCR/qPCR de los eluidos. Para la detección de los aptámeros unidos al blanco en la nitrocelulosa, en Westerns o cuadrículas, se utilizó la biotinilación en el extremo 5´ y el revelado mediante estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina, HRP o CY3. Se espera que estos aptámeros puedan servir para detectar IL-1β y para bloquear la unión a sus receptores. Subsidios PIP 2009-2011,2012-2014/ PICT 2012, 1278.