Desarrollo de un adenovirus recombinante no replicativo como control interno de procesos de Virología ambiental y alimentaria

MARIA DOLORES BLANCO FERNANDEZ; OSCAR ALBERTO TABOGA; VIVIANA A. MBAYED

Buenos Aires

Congreso; XI Congreso Argentino de Virología, II Congreso Latinoamericano de Virología; 2015

Debido a su alta infectividad, persistencia en el medio y tolerancia a tratamientos, los virus entéricos humanos son uno de los principales agentes causales de enfermedades asociadas al consumo de alimentos o aguas contaminados. La detección de estos virus en aguas y alimentos se basa en la concentración y/o elusión de los virus desde matrices sólidas o líquidas seguidas de técnicas moleculares para la detección de ácidos nucleicos. No existe todavía un consenso acerca de los protocolos a utilizar y la metodología desarrollada hasta el momento presenta una alta variabilidad intra e interlaboratorios. A su vez, la presencia de inhibidores en muestras ambientales y alimentos interfiere en la detección y cuantificación de los virus presentes, lo que hace necesaria la inclusión de controles internos virales que permitan evaluar integralmente los diferentes procesos de la Virología ambiental y de alimentos. El objetivo del trabajo fue generar adenovirus recombinantes no replicativos como controles internos de amplificación de genomas virales y de procesos de Virología ambiental y alimentaria. Se sintetizaron químicamente 2 construcciones con las regiones genómicas apropiadas para la detección por PCR cuantitativa en tiempo real [(q)PCR] de virus humanos que pueden encontrarse en el ambiente. Una representa a virus con genoma ARN (enterovirus, virus de hepatitis A, norovirus, virus de hepatitis E y rotavirus) y la otra representa a virus con genoma ADN (adenovirus y poliomavirus). La región de amplificación de cada virus se diseñó manteniendo el tamaño, el porcentaje de GC y los sitios de hibridación cebadores de los virus nativos pero modificando la secuencia interna de complementariedad con sondas específicas. Para la generación de partículas virales, se utilizó un vector basado en adenovirus (CellBiolabsRAPAd® AdenoviralExpressionSystem). Las dos construcciones se clonaron en el vector pacA5K-NpA y se cotransfectaron junto a un vector ?helper? (pacAd5 9.2-100) en células HEK 293A utilizando un agente de transfección de polímeros catiónicos (X-tremeGENE 9, Roche). La progenie viral obtenida se amplificó en esta misma línea celular, que aporta la región genómica E1 que no está incluida en el vector viral para impedir su replicación. Los stocks virales generados se cuantificaron utilizando ensayos de dilución de punto final, alcanzándose títulos en el orden de 109 TCID50/ml. El adenovirus control obtenido en este trabajo permitirá la evaluación de metodología aplicada a la detección de virus en agua y alimentos, así como la eficiencia de extracción de ácidos nucleicos y de las (q)PCRs de los virus entéricos incluidos en el diseño. Además, podrá incorporarse de rutina a las muestras reales evaluadas para controlar la performance de los procesos.