Selección de clones transformantes de la levadura metilotrófica Pichia pastoris con mayor producción de quimosina bovina recombinante

NOSEDA DIEGO GABRIEL; BOZZO JOAQUIN ; RECUPERO MATIAS; GALVAGNO MIGUEL

Chascomus

Congreso; Congreso de la Sociedad Argentina de Biología (SAB); 2013

Sociedad Argentina de Biología

La quimosina bovina es la enzima proteolítica preferida para la elaboración de quesos porque es capaz de clivar específicamente las k-caseínas, provocando la coagulación de la leche. Previamente, hemos expresado esta enzima en la levadura metilotrófica Pichia pastoris bajo control del promotor AOX1, el cual es fuertemente inducido por metanol. Este sistema de expresión presenta importantes ventajas como ser la eficiente expresión de proteínas heterológas con modificaciones post-traduccionales. Objetivos: Determinar mediante el ensayo de actividad coagulante, clones transformantes de P. pastoris que produzcan mayor cantidad de quimosina bovina recombinante en medio YPD (glucosa como fuente de carbono). A partir de los clones seleccionados, efectuar una segunda selección de transformantes que produzcan elevado nivel de quimosina en medio basal salino (MBS), con glicerol como fuente de carbono. Evaluar el crecimiento de uno de los clones en MBS conteniendo glicerol derivado del biodiesel. Analizar la estabilidad de la quimosina recombinante en función de distintas temperaturas (5°C, 20°C y 37°C). Resultados: A partir de 100 clones de P. pastoris se identificaron 15 clones con mayor producción de quimosina bovina recombinante en medio YPD. A partir de la segunda selección en MBS, se determinó que 5 clones presentaron mayor actividad coagulante. Se alcanzó un óptimo crecimiento en MBS con glicerol derivado del biodiesel, obteniendo parámetros cinéticos similares a los conseguidos con glicerol analítico. El análisis de la estabilidad de la quimosina recombinante permitió establecer que la actividad coagulante se mantuvo estable cuando su incubación se realizó a 5°C durante 90 días.