Estrategias para la Purificación Primaria de una Bacteriocina producida por una Cepa de Enterococcus faecalis

M. M. CARDOSO; R. M. MANZO; G. G. TONARELLI; A.C. SIMONETTA

Ciudad Autónoma de Buenos Aires; 7 al 11 de Noviembre

Congreso; I Congreso Latinoamericano de Microbiología de Medicamentos. I Congreso Argentino de Microbiología de Medicamentos. I Simposio de Microbiología de Cosméticos; 2005

División Alimentos, Medicamentos y Cosméticos (DAMYC) perteneciente a la Asociación Argentina de Microbiología

El grupo mejor estudiado de bacterias Gram (+) con actividad antimicrobiana es el de las bacterias ácido lácticas, productoras de un gran número de bacteriocinas de variada naturaleza, cuya aplicación terapéutica potencial como alternativa o como complemento de los antibióticos tradicionales se investiga y discute extensamente. En función de esto se seleccionó una cepa de Enterococcus faecalis de colección propia, caracterizada como probable productora de una bacteriocina, y se procedió a la purificación preliminar de esta sustancia. El sobrenadante libre de células se obtuvo centrifugando el cultivo, luego se lo concentró 10 veces por evaporación bajo vacío, se lo esterilizó por filtración y se lo caracterizó mediante ensayos enzimáticos y fisicoquímicos, incluyendo determinación de PM aparente. En todos los casos se utilizó el método de difusión en agar para determinar la actividad inhibitoria frente a bacterias indicadoras Gram (+) y Gram (-). Dicha actividad también fue titulada midiéndola en distintas diluciones y el título fue expresado como AU/mL. La purificación se llevó a cabo aplicando el sobrenadante concentrado a una columna de intercambio iónico de carboximetil-celulosa de 2,5 por 15 cm, equilibrada con agua y lavada sucesivamente con agua (100 mL), NaCl 0,1M (100 mL) y NaCl 0,5 M (100 mL); se colectaron fracciones de 5 mL y se midió absorbancia a 280 nm y a 220 nm. Las fracciones activas fueron concentradas y aplicadas a una columna de C18 (2,5 x 10 cm) equilibrada con agua y lavada sucesivamente con agua y soluciones crecientes de Acetonitrilo-agua del 10% al 100%. Las fracciones activas colectadas fueron concentradas y aplicadas a una columna de Sephadex G-25 (2,5 por 50 cm); la elución se realizó con agua a pH 7.0 y a las fracciones colectadas (5 mL) se les midió la absorbancia a 280 y 220 nm. También se realizó intercambio iónico con SP-Sepharosa; el sobrenadante fue pasado por una columna con SP-Sepharosa de 2,5 x 20 cm, se lavó con acetato de amonio 0,05M, se eluyó la fracción activa con acetato de amonio 0,1M y se continuó la purificación con una columna de C18. La sustancia en estudio mostró un amplio espectro inhibitorio frente a bacterias Gram(+) y Gram(-) causantes de diversas patologías humanas y animales, estabilidad a pH entre 5 y 7, termorresistencia y PM < 3 kDa. La purificación parcial mostró retención de una fracción activa con SP-Sepharosa que fue eluida con acetato de amonio 0,1M. El intercambio iónico con carboximetil-celulosa mostró actividad en la fracción acuosa. Los resultados indican la presencia de una sustancia activa muy hidrofílica o que forma agregados con otras proteínas del medio que no están lo suficientemente cargadas como para interaccionar con la columna, por lo que para ser retenida necesita un intercambiador catiónico fuerte. También posee hidrofobicidad, ya que con la columna de C18 la actividad se encuentra en la fracción 20% de acetonitrilo-agua. La sustancia en estudio mostró un amplio espectro inhibitorio frente a bacterias Gram(+) y Gram(-) causantes de diversas patologías humanas y animales, estabilidad a pH entre 5 y 7, termorresistencia y PM < 3 kDa. La purificación parcial mostró retención de una fracción activa con SP-Sepharosa que fue eluida con acetato de amonio 0,1M. El intercambio iónico con carboximetil-celulosa mostró actividad en la fracción acuosa. Los resultados indican la presencia de una sustancia activa muy hidrofílica o que forma agregados con otras proteínas del medio que no están lo suficientemente cargadas como para interaccionar con la columna, por lo que para ser retenida necesita un intercambiador catiónico fuerte. También posee hidrofobicidad, ya que con la columna de C18 la actividad se encuentra en la fracción 20% de acetonitrilo-agua. La sustancia en estudio mostró un amplio espectro inhibitorio frente a bacterias Gram(+) y Gram(-) causantes de diversas patologías humanas y animales, estabilidad a pH entre 5 y 7, termorresistencia y PM < 3 kDa. La purificación parcial mostró retención de una fracción activa con SP-Sepharosa que fue eluida con acetato de amonio 0,1M. El intercambio iónico con carboximetil-celulosa mostró actividad en la fracción acuosa. Los resultados indican la presencia de una sustancia activa muy hidrofílica o que forma agregados con otras proteínas del medio que no están lo suficientemente cargadas como para interaccionar con la columna, por lo que para ser retenida necesita un intercambiador catiónico fuerte. También posee hidrofobicidad, ya que con la columna de C18 la actividad se encuentra en la fracción 20% de acetonitrilo-agua. La sustancia en estudio mostró un amplio espectro inhibitorio frente a bacterias Gram(+) y Gram(-) causantes de diversas patologías humanas y animales, estabilidad a pH entre 5 y 7, termorresistencia y PM < 3 kDa. La purificación parcial mostró retención de una fracción activa con SP-Sepharosa que fue eluida con acetato de amonio 0,1M. El intercambio iónico con carboximetil-celulosa mostró actividad en la fracción acuosa. Los resultados indican la presencia de una sustancia activa muy hidrofílica o que forma agregados con otras proteínas del medio que no están lo suficientemente cargadas como para interaccionar con la columna, por lo que para ser retenida necesita un intercambiador catiónico fuerte. También posee hidrofobicidad, ya que con la columna de C18 la actividad se encuentra en la fracción 20% de acetonitrilo-agua... El resumen continúa en el texto completo