LA SOBREEXPRESIÓN DE RAC3 ES UN FACTOR CLAVE PARA LA TRANSICIÓN EPITELIO MESENQUIMÁTICA INDUCIDA POR TNF

PANELO L.C.; RUBIO M F; FERNANDEZ LARROSA P N; COSTAS M A

Buenos Aires

Jornada; Jornadas Científicas Lanari; 2014

Instituto de Investigaciones Médicas Alfredo Lanari

El microambiente tumoral condiciona el crecimiento y la capacidad metastásica de células tumorales. Las citoquinas estimulan el crecimiento y la transición epitelio mesenquimática (TEM) y probablemente favorecen la adquisición o preservación de fenotiposstem cell tumorales. Se ha reportado que TNF, a través del aumento en la actividad NF-kB y TCF/B-catenina es capaz de inducir TEM y aumentar la expresión de marcadores stem cell tumorales lo cual está asociado a un aumento en la capacidad metastásica de células tumorales. Demostramos previamente que RAC3 (coactivador del factor de transcripción NF-kB), es un oncogén cuya sola sobreexpresión aumenta la capacidad proliferativa, resistencia a apoptosis, induce TEM (aumento de vimentina, secreción de MMPs, capacidad migratoria y disminución de E-cadherina). Por tal motivo decidimos investigar si la sobreexpresión de RAC3 contribuye a la acción metastásica de TNF. Para ello se generaron clones de células no tumorales HEK293 con alta expresión de RAC3 (que naturalmente expresan bajos niveles) y tumorales T47D y HeLa con bajo RAC3 (naturalmente alto) por transfección estable con el vector de expresión RAC3 o el siRNA para RAC3, respectivamente. Se estimularon por 24hs con: TNF (15ng/ml), SZ (sulfazalacina 250mM inhibidor de NF-kB) o TNF+SZ o Basal. Se analizó capacidad migratoria por la técnica de cicatrización de la herida observándose un aumento del 32.8±7.7%, 18.14±2.85 y 34.39±5.88% en células con alto RAC3 (HekRAC3, T47D y HeLa ctrol) respecto de células con bajo RAC3, que aumenta al 50.36±4.33%, 48.20±3.22% y 52.04±9.8% con TNF, siendo dicho efecto revertido, en todos los casos, por SZ. Los clones con bajos niveles de RAC3 (Hek ctrol, T47D y Hela +siRNA), muestran una clara incapacidad de cicatrizar la herida aún bajo el estímulo de TNF. Para determinar cómo la sobreexpresión de RAC3 puede favorecer la capacidad invasiva bajo el estímulo con TNF se determinó por zimografía actividad MMP2 y 9 en clones Hek± RAC3, observándose un aumento del 300% por alta expresión de RAC3 respecto de Hek293 control en condiciones basales, que se incrementa a un 558% bajo el estímulo de TNF, siendo revertido por Sz. Los niveles de marcadores TEM fueron analizados por WB en células Hek±RAC3, observándose un aumento de 172.5±11.3%, 220.8±33.6% y de 210±28% en Vimentina, N-cadherina; B-catenina respectivamente y una disminución de 47,5±15% en de los niveles de E-cadherina, respecto de Hek293 control, en condiciones basales. El estímulo con TNF incrementó 336.4±22.3% vimentina e inhibió 67.87±1.6% E-cadherina, efectos que fueron bloqueados por SZ. Los niveles de B-catenina y N-cadherina no se modificaron. No se observó efecto de TNF sobre la actividad MMP, Vimentina, N-cadherina, B-catenina y E-cadherina si RAC3 no está sobreexpresado. Se analizó la localización subcelular y cinética de translocación de B-catenina por inmuno fluorescencia en clones HEK y Hela con alto o bajo RAC3. Bajo estímulo con TNF y alta expresión de RAC3 se observó disminución de localización en membrana plasmática y translocación a núcleo (Hek+RAC3 y HeLa ctrol) efecto revertido por Sz. Por el contrario, en clones con bajo RAC3 (Hek ctrl y HeLa +siRNA) la localización de B-catenina fue en membrana plasmática y no se modificó por estímulo con TNF. Ensayos preliminares con plásmidos reporteros para TCF/B-catenina en células Hek±RAC3, mostraron un aumento en la actividad reportera del 150 +/- 10 % en condiciones basales y de 500 +/- 12 % bajo el estímulo con TNF cuando RAC3 está sobreexpresado. Estos resultados sugieren que la sobreexpresión de RAC3 es un componente clave para el aumento en la capacidad metastásica de células tumorales inducida por TNF y podrían ser consecuencia de la actividad transcripcional de NF-kB y TCF/B-catenina.