BIOMSID: IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS ACTIVOS MEDIANTE BIOAUTOGRAFÍA ACOPLADA A EMAR

RAMALLO, IVANA A.; SALAZAR, MARIO O.; FURLÁN, RICARDO L. E.

Los Cocos, Córdoba

Congreso; II CONGRESO ARGENTINO DE ESPECTROMETRÍA DE MASA; 2014

Sociedad Argentina de Espectrometía de Masas

Se presenta BIOMSID,1 una nueva estrategia para la identificación de inhibidores que combina la habilidad de la bioautografía para detectar in situ inhibidores en mezclas complejas, con la capacidad de la espectrometría de masas de alta resolución (EMAR) para determinar fórmulas moleculares. Así, se establece una rápida conexión entre actividad inhibitoria y la identidad del compuesto activo. En una primera etapa se separa la muestra por CCD, y se revela bioautográficamente. Luego, se toman muestras de la zona de inhibición (halo) y de la matriz coloreada (control), y se adquieren los espectros de EMAR. Por último se procesan los espectros mediante un algoritmo en MatLab, que detecta cuáles señales corresponden al compuesto activo. El método se basa en que la composición química no vinculada con la bioactividad en un halo puede ser distinta en CCDs de la misma muestra con distintas fases móviles. Siendo así, la comparación entre espectros permite la detección de iones comunes, y por lo tanto la identificación del compuesto activo. La puesta a punto se baso a la búsqueda de inhibidores de acetilcolinesterasa (AChE), principal blanco para el tratamiento de la enfermedad de Azheimer.2 Con el fin de facilitar la extracción de los compuestos para el análisis por EMAR, se desarrolló un nuevo ensayo bioautográfico mediante inmovilización de AChE en agar. El algoritmo desarrollado para la etapa de análisis se basa en dos parámetros: % de filtro (%F) y tolerancia (Tol). El %F define la intensidad por encima de la cual se toma en cuenta a una señal para el cálculo. La Tol define el rango m/z dentro del cual se asume que dos valores son iguales. La rutina consiste en: 1) filtrar el espectro del halo A y su control con un valor %F; 2) restar el control A filtrado al halo A filtrado; 3) repetir los pasos 1 y 2 con los halo/control B y C; 4) identificar los valores de m/z comunes en los sets A, B y C. La utilidad de la estrategia se demostró con un extracto de Brassica rapa pinchado al 0.1% con eserina (inhibidor de AChE3). Se utilizaron en paralelo 3 CCD desarrolladas con diferentes solventes, la cuales, se revelaron bioautográficamente y se tomaron, por cada placa, muestras de la capa de agar (halo y control). Los geles se lavaron con DCM y se adquirieron los espectros de EMAR para ser procesados con MatLab. En una primera etapa, el algoritmo filtró todas las señales no relacionadas con la actividad (buffer, revelador, sustrato). En una segunda etapa, se compararon los espectros filtrados detectando señales comunes que se corresponden con eserina(C15H21N3O2); se identificaron los valores m/z: 276,1702m/z [M+1]+ y 298,1524m/z [M+Na]+. La metodología se aplicó también para el extracto metanólico de Ilex paraguariensis, revelando dos valores pertenecientes al compuesto activo: 195.0878 m/z [M+H]+ and 217.0700 m/z [M+Na]+. Los mismos son iones relacionados a la fórmula molecular C8H10N4O2 perteneciente a cafeína, cuya presencia se ha reportado en la especie.4 El desarrollo de un ensayo simple y cálculos estratégicos facilitan la determinación de las fórmulas moleculares de compuestos bioactivos en una mezcla compleja, incluso cuando son constituyentes minoritarios. Además de extractos vegetales, BIOMSID podría aplicarse para analizar cualquier tipo de extracto activo, frente a AChE y/o frente a otros blancos biológicos. En toxicología, sería aplicable para análisis de efecto directo.