Caracterización y Purificación Parcial de un Sobrenadante Libre de Células Proveniente de una Cepa de Enterococcus

M. M. CARDOSO; R. M. MANZO; G. G. TONARELLI; A.C. SIMONETTA

Santa Fe; 16 al 18 de Junio

Jornada; III Encuentro Bioquímico del Litoral. VI Jornadas de Comunicaciones Técnico-Científicas; 2005

Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional del Litoral, Colegio de Bioquímicos de la Provincia de Santa Fe-Primera Circunscripción, Colegio de Bioquímicos de la Provincia de Entre Ríos y otro.

El grupo mejor estudiado de bacterias Gram (+) con actividad antimicrobiana es el de las bacterias ácido lácticas (LAB), productoras de un gran número de bacteriocinas, cuya aplicación potencial como biopreservadores alimentarios se investiga y discute extensamente. Se estudió una cepa de Enterococcus faecalis de colección propia, previamente seleccionada como probable productora de una bacteriocina, y se procedió a la caracterización y purificación preliminar de esta sustancia. La cepa se propagó durante 24h a 37ºC en caldo M17. El sobrenadante libre de células se obtuvo centrifugando el cultivo, y luego se lo concentró 10 veces por evaporación bajo vacío y se lo esterilizó por filtración, procediendo a su caracterización preliminar mediante ensayos enzimáticos y fisicoquímicos. En todos los casos se utilizó el método de difusión en agar para determinar la actividad inhibitoria frente a cepas bacterianas indicadoras Gram (+) y Gram (-). Partiendo del sobrenadante parcialmente concentrado la purificación se llevó a cabo empleando dos esquemas diferentes. En el primer protocolo se empleó cromatografía de intercambio iónico sobre carboximetil-celulosa, elución con agua, 0,1M NaCl y 0,5 M NaCl; cromatografía en fase reversa sobre C18 (Sep-Pak-Waters), elución con gradiente de acetonitrilo-agua (10-100%). Las fracciones activas fueron aplicadas a una columna de Sephadex G-25 y la elución se realizó con agua Mili Q. En todos los casos se midió la absorbancia de las fracciones recolectadas a 220 y 280 nm. En el segundo protocolo se utilizó ultrafiltración (Centriprep.-cut-off 3000Da) y cromatografía de intercambio iónico sobre SP-Sepharosa eluyendo con agua y con 0,25M y 1,5M de NaCl. Los compuestos activos en estudio mostraron un amplio espectro inhibitorio frente a bacterias Gram(+) y Gram(-), estabilidad a pH entre 5 y 7 y termorresistencia. En la purificación con carboximetil-celulosa las fracciones activas no fueron retenidas por el intercambiador. A diferencia de ello, el empleo de geles de SP-Sepharosa permitió obtener dos fracciones activas: una por elución con agua y la segunda por elución con NaCl 1,5M. Los resultados sugieren la presencia de uno o más péptidos bioactivos de peso molecular comprendido en el rango de 3000 a 5000 Da, de naturaleza hidrofílica y la conveniencia de utilizar intercambiadores catiónicos fuertes para la purificación de los mismos.