Comparación de dos protocolos de purificación efectuados sobre un sobrenadante libre de células proveniente de una cepa de Enterococcus

M. M. CARDOSO; R. M. MANZO; A.C. SIMONETTA; G. G. TONARELLI

San Luis, Argentina

Congreso; XXVI Congreso Argentino de Química. Dr. Ángel del Carmen Devia; 2006

Asociación Química Argentina (AQA)

Introducción Las bacterias lácticas (BAL) poseen gran importancia económica ya que, bien de forma natural o adicionadas intencionadamente, desempeñan un papel importante en la fermentación de una gran variedad de alimentos. En contraposición con los aditivos químicos, los consumidores perciben a las bacterias lácticas como algo “natural” y “beneficioso para la salud”, por lo que su empleo en la conservación de los alimentos tiene gran aceptabilidad. En años recientes se ha demostrado la capacidad de estas bacterias para producir, además de los productos finales de fermentación (ácido láctico y acético, dióxido de carbono, peróxido de hidrógeno, diacetilo, etc.), otras sustancias que inhiben el desarrollo microbiano conocidas como bacteriocinas. Estas son proteínas o péptidos capaces de inhibir el desarrollo de otras bacterias estrechamente relacionadas con la cepa productora; actualmente se considera que muchas bacteriocinas poseen un espectro de acción antibacteriano más amplio, que alcanza a especies bacterianas Gram (-), incluyendo en el mismo a géneros y especies alteradoras o causantes de enfermedades de transmisión alimentaria (ETAs). Esto, unido a sus propiedades fisicoquímicas y fisiológicas y a que las bacterias del ácido láctico son consideradas por la Organización Mundial de la Salud como GRAS, hace que las mismas presenten un gran interés para su utilización como “biopreservadores naturales” en la industria alimentaria. En función de esto, se estudió una cepa que pertenece a la colección de la Cátedra de Microbiología y Biotecnología de la Fac. de Ing. Química (UNL) denominada Enterococcus faecalis DBFIQ E24, aislada de leche bovina y seleccionada previamente como probable productora de sustancias tipo bacteriocina. Materiales y métodos Determinación de la actividad antagonística. Para determinar la actividad inhibitoria de los extractos y de las fracciones parcialmente purificadas se utilizó el método de difusión en agar (1). Se utilizaron dos cepas de prueba: una Gram (+), Bacillus cereus, y una Gram (-), Escherichia coli. Se determinó el título de la actividad antimicrobiana, definido como la inversa de la máxima dilución a la cual se observa inhibición de la cepa indicadora dividido por el volumen (en mL) y se expresa como unidades arbitrarias de actividad por mililitro (AU/mL). Obtención del sobrenadante: El sobrenadante libre de células se obtuvo a partir de un cultivo final preparado agregando 30 mL de un precultivo a 1000 mL de Caldo M17 (Biokar). Se incubó a 37ºC durante 24 h, y luego se centrifugó a 6000 r.p.m. durante 15 min a 4ºC. Posteriormente el sobrenadante libre de células fue concentrado 10 veces a 70 ºC en un evaporador rotatorio o se lo calentó a una temperatura de 70 ºC durante 45 minutos para inhibir las enzimas proteolíticas, y a continuación se lo esterilizó por filtración utilizando membranas de 0,22 µm de diámetro de poro (Sartorius). Ensayos de purificación Primer protocolo: el sobrenadante libre de células concentrado se aplicó a una columna de intercambio iónico SP-Sepharosa Fast Flow (Amersham Biosciences) equilibrada con una solución de acetato de amonio 50 mM, pH 4.5. La elución se realizó con acetato de amonio 0.1 a 0.4 M (2). Se juntaron las fracciones y se midió la absorbancia a 230 y 280 nm. Se determinó la actividad antimicrobiana de las fracciones liofilizadas. A la fracción activa se le agregó TFA a una concentración final de 0.1 % v/v y se la aplicó a una columna Sep-Pak de C18 (Waters, 35 cc.) equilibrada con agua; se lavó con solución acuosa conteniendo 0.1% TFA (v/v), y la elución se efectuó con mezclas de acetonitrilo- agua (desde 20 al 100% (v/v)), en presencia de 0.1% de TFA. Las muestras fueron concentradas, liofilizadas y reconstituidas en agua antes de evaluar su actividad antagonística. Segundo protocolo: el sobrenadante libre de células sin concentrar se trató a 70 º C durante 45 minutos, y posteriormente se realizó una precipitación salina con sulfato de amonio al 80 % de saturación (3). Luego de mantener la muestra a 4 ºC durante 2 h, se centrifugó a 12000xg durante 20 min a 4 ºC. El precipitado se solubilizó con la menor cantidad de buffer fosfato 40 mM, pH 7.0 (4). La desalinización de la muestra se realizó con Sephadex G-10, empleando como eluyente acetato de amonio 0.05 M, pH 5.0. Como paso posterior se realizó extracción en fase sólida con una columna Sep-Pak (C18), empleando condiciones experimentales similares a las descriptas en el Protocolo 1. Análisis de las fracciones por HPLC: como seguimiento de las diferentes etapas de  purificación, se realizaron análisis por cromatografía líquida de alta performance (HPLC) en un equipo Gilson (USA). Se utilizó una columna analítica Júpiter Proteo (Phenomenex) de 90 Å, tamaño de partícula 4 µ, dimensiones 250 x 4,60 mm. Solvente A: agua con 0.1% TFA; Solvente B: ACN con 0.08% TFA. Se empleó el siguiente gradiente lineal de elución: 2% al 80% de B en 30 minutos. Resultados En las Tablas 1 y 2 se muestran los resultados obtenidos con los dos protocolos de purificación utilizados (Ver Tablas 1 y 2 en el archivo). Como resultado de la cromatografía de intercambio catiónico (CIC) se observó un aumento de 10.2 veces en la actividad específica inicial. No obstante, la recuperación de la sustancia antimicrobiana por este método fue baja (2%). Durante la posterior cromatografía en fase reversa se observó que parte de la actividad quedaba en los lavados (no indicado en Tabla 1), y además se obtuvo una fracción activa por elución con 20% de ACN. En el segundo protocolo, mediante la precipitación salina del sobrenadante libre de células se obtuvo buen porcentaje de recuperación (32 %). En cuanto a la cromatografía en fase reversa, solamente la fracción del lavado de la columna de C18 resultó ser activa. Del análisis de los resultados obtenidos con los dos protocolos se deduce la escasa interacción de los compuestos activos con las columnas de C18 utilizadas. Las fracciones activas obtenidas por los dos protocolos mostraron por HPLC un perfil cromatográfico similar. De las diferentes columnas analíticas que se han utilizado para este trabajo, la mejor resolución se obtuvo con la Júpiter Proteo (Phenomenex). Se continúa trabajando en la purificación por HPLC semipreparativa en fase reversa de los componentes activos, a fin de poder realizar posteriormente la caracterización estructural de los mismos. Conclusiones Los resultados son indicativos de la complejidad de los sobrenadantes de cultivos y de las limitaciones que se encuentran para la purificación completa de los compuestos activos, con buenos rendimientos. Estas limitaciones están asociadas a la baja concentración de las bacteriocinas en el sobrenadante de cultivo, a la formación de agregados y a la posible interacción con otros componentes del medio de cultivo. La utilización de columnas Sep-Pak C18 permitió eliminar compuestos coloreados y péptidos/proteínas del medio de cultivo, funcionando de esta manera como un adecuado método de clean-up. El aumento de la actividad específica detectado en la etapa de intercambio catiónico con SP-Sepharosa confirma el carácter esencialmente catiónico que poseen estos péptidos antimicrobianos de bajo peso molecular. Del conjunto de los datos obtenidos en este trabajo resulta la conveniencia de utilizar un método de concentración como primera etapa en el proceso de purificación, seguido por cromatografía en fase reversa e intercambio iónico. Como paso final, la purificación hasta homogeneidad de los compuestos activos debe realizarse por HPLC. Bibliografía: 1.      Tagg J. R., Mc Given A. R. “Assay systems for bacteriocins”. 1971. Appl. Environ. Microbiol. 21: 943-947. 2.      Guyonnet, D., Fremaux, C., Cenatiempo Y. and Berjeaud J. M. “Method for rapid purification of Class IIa Bacteriocins and comparison of their activities”. 2000. Appl. Environ. Microbiol. 66: 1744-1748. 3.      Methods in molecular biology. Volume 244: “Protein purification protocols”. Second Edition. Edited by Paul Cutler. 2004. Editorial Humana Press. Totowa, New Jersey. 4.   Herranz, C., Mukhopadhyay, S., Casaus, P., Martínez, J.M., Rodríguez, J.M., Nes, I.F., Cintas, L.M., Hernández, P.E. “Biochemical and Genetic Evidence of Enterocin P Production by Two Enterococcus faecium-Like Strains from Fermented Sausages”. 1999. Curr. Microbiol. 39: 282-290.