Relación entre la morfología de COCs inmaduros porcinos y el desarrollo in vitro de embriones

TELLO MF; LORENZO MS; LUCHETTI CG; MARURI A; CLAVER JA; SALAMONE DF; LOMBARDO DM

CABA

Congreso; 2° Congreso Internacional de la Sociedad Argentina de Tecnologías Embrionarias; 2014

SATE

El objetivo del trabajo fue determinar si la morfología de los COCs inmaduros de porcinos está relacionada con la apoptosis, los porcentajes de maduración ovocitaria y el desarrollo embrionario posterior a la fecundación.Los COCs se obtuvieron por aspiración de folículos de 3-8 mm a partir de ovarios de cerdas de faena. Se clasificaron bajo lupa estereoscópica en seis categorías (A1, A2, B1, B2, C y D) según su morfología. Se determinó el porcentaje de ovocitos con apoptosis temprana por la técnica de Anexina V-Ioduro de Propidio y la apoptosis tardía por la técnica de TUNEL. Las categorías A1, A2 y B1 (cumulus íntegro) se maduraron in vitro durante 44-48 h en medio TCM 199 suplementado con 10% (v/v) de fluido folicular porcino, 50mg/L de gentamicina y 0,5 mg/L de FSH y LH porcinas. Se denudaron (hialuronidasa 1mg/mL) y tiñeron con Hoechst 33342 para determinar el porcentaje de maduración nuclear. Aquellos ovocitos en estadio de Metafase II y con extrusión del primer corpúsculo polar se consideraron maduros. Se realizó fecundación invitro y se comparó el desarrollo embrionario de las categorías A y B1, se agruparon A1 y A2 ya que no difirieron en maduración nuclear ni apoptosis. Semen fresco porcinode fertilidad probada fue centrifugado 3 veces (490 x g, 5 min) en medio BO + 2,5 mM glucosa, 10 mMNa lactato, 5 mM cafeína y 20 IU/mL heparina y diluido ½ en BO+10 mg/mL FAF-BSA (concentración de espermatozoides= 1 x106/mL). Los ovocitos maduros denudados y los espermatozoides se coincubaron en gotas de 100 µL por 30 min a 39 °C, 5% CO2 y humedad 100 %. Los presuntos cigotos se enjuagaron en medio TALP-HEPES y se cultivaron en gotas de 50 µL de medio SOF a 39 °C, 5% CO2, 5 % O2 y humedad 100 %.Se determinó el porcentaje de clivaje adía 4 de cultivo y de blastocistos a día 8-9. Se utilizó el software Infostat (v2011), realizando pruebas de independencia y regresión para evaluar apoptosis, ANOVA para los porcentajes de maduración y test de Fisher para los porcentajes de clivaje y blastocistos, considerando significativo un p≤0,05. El porcentaje de apoptosis temprana en ovocitos inmaduros aumentó al disminuir la calidad de los COCs, sin embargo no se observaron diferencias entre las categorías A1 y A2 (n= 363). No se observó apoptosis tardía en ovocitos inmaduros. No se observaron diferencias significativas en el porcentaje de maduración nuclear entre A1, A2 y B1 (n= 106), así como tampoco en el porcentaje de clivaje ni de blastocistos entre A1+A2 y B1 (n=306). En conclusión, la apoptosis en COCs inmaduros está relacionada con su morfología. A pesar de las diferencias en apoptosis, los ovocitos que están rodeados por una única capa completa de células del cumulus (B1) tienen la misma capacidad de desarrollo in vitro que aquellos con cumulus denso y abundante (A1 y A2). La observación del cumulus en los COCs inmaduros puede servir como criterio de selección de ovocitos con buen potencial de desarrollo in vitro.