Detección de todas las mutaciones activantes reportadas del oncogén NRAS humano mediante la utilización de Generadores de Heterodúplex

BELLI, CAROLINA; DE BRASI, CARLOS; LARRIPA, IRENE

Mar del Plata

Congreso; XLVIII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica y LI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Inmunología; 2003

SAIC

Las mutaciones puntuales del gen NRAS que afectan los codones 12, 13 y 61 han sido reportadas en varios tumores y enfermedades hematológicas. Aunque existen numerosos métodos para el análisis de dichas mutaciones, ellos presentan desventajas asociadas a la especificidad y/o sensibilidad. El método de GH se basa en el comportamiento electroforético diferencial de heterodúplex inducidos entre la muestra incógnita y un generador sintético, el cual posee un identificador de las mutaciones a analizar. Objetivo: Diseñar un nuevo GH capaz de detectar las mutaciones del codón 61 y que funcione en multiplex, junto al ya descripto para los codones 12 y 13 (Belli et al. Hum Mut 2003), a fin de detectar todas las mutaciones activantes del gen NRAS. El GH-61, cuyo indicador es una inserción de 5T, discriminó las 7 mutaciones (panel de plásmidos mutantes) de la secuencia normal y fue capaz de trabajar en conjunto al GH-12-13 en PCR multiplex. Así, en un solo ensayo pueden ser discriminados los 19 patrones alterados de los 2 patrones normales. El método fue probado en 6 pacientes, en líneas celulares hematológicas (HL60, AL-HL3, Molt-4, P39, RS4-11) y en 19 plásmidos con diferentes mutaciones previamente caracterizadas y/o reportadas. Mediante la utilización de controles normales (15 dadores sanos y la línea celular K562) se descartó la presencia de falsos (+). Esta metodología resultó altamente específica, sensible, reduce tiempos y costos, dado que sólo requiere una amplificación por PCR y una electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante. Este método, capaz de identificar las 19 mutaciones de los codones 12, 13 y 61 del gen NRAS, representa una alternativa para la detección de dichas alteraciones fácilmente aplicable al análisis de series clínicas y a la rutina diagnóstica.