PARTICIPACIÓN DE LA HORMONA LIBERADORA DE TIROTROFINA (TRH) EN LA CARDIOTOXCICIDAD INDUCIDA POR DOXORRUBICINA (D).

PERES DIAZ, LUDMILA; SCHUMAN, MARIANO LUIS; MARÍA SILVINA LANDA; TOBLLI, JORGE E.; GONZALEZ MANSILLA, NOELIA L; ALVAREZ, AZUCENA L; GARCIA, SILVIA INES

CABA

Jornada; XII Jornadas Científicas del Instituto de Investigaciones Médicas Alfredo Lanari.; 2013

Instituto de Investigaciones Médicas Alfredo Lanari

Demostrado que el sistema de la TRH está hiperactivado en el VI hipertrofiado de las ratas SHR. Su bloqueo previene la HVI a pesar de la severa  hipertensión presente sugiriendo la participación del tripeptido en este proceso. También describimos que la sobreexpresión de TRH en el VI, por inyección intracardiaca de un plásmido que sobreexpresa TRH, induce el fenotipo del corazón hipertrofiado en una rata  normal. Sabemos que en la HVI participan procesos como la hipertrofia  fibrosis y apoptosis de las células cardiacas. Por otro lado la D es un agente neoplasico utilizado en numerosas terapias con uso limitado por la cardiotoxcicidad que induce. Aún el mecanismo inductor del daño se desconoce pero fue sugerido la participación de las especies reactivas del oxigeno.   Nos resultó interesante estudiar si el sistema de la TRH cardiaco  participa en los procesos de daño inducidos por D. Estudiamos si el tratamiento con D (100 uM, 24hs) estimulaba el sistema de la TRH en cultivos de fibroblastos cardíacos de Wistar neonatos (FC). Utilizamos el indice apoptótico Bax/Bcl2 como marcador de efectividad de D. Estimulamos (24 hs) FC con  TRH (10 y 100 uM) y evaluamos su efecto sobre el índice apoptotico mencionado. "In vitro", (FC) la D provocó un aumento significativo del índice apoptotico Bax/BcI2 (p=0.028) indicando la efectividad de la droga. Como hipotetizamos, hubo un aumento de la expresión de TRH de 4 veces vs el control (p<0.001) (Anova, Tukey test). Observamos que el agregado de TRH indujo un aumento del índice Bax/Bcl2 (p<0.05) en forma dosis dependiente  sugiriendo que la TRH podría estar involucrada en la cardiotoxicidad de la D. Desarrollamos un modelo ?in vivo? utilizando ratones C57 con o sin inhibición de  TRH mediante siRNA intracardiaco previo al estimulo con D, ( no contamos con antagonistas comerciales).   El siRNA es un tipo de RNA doble cadena de 20-24 nucleótidos que interviene en el mecanismo denominado interferencia de ARN (RNA interference, RNAi), donde el siRNA inhibe de forma prolongada la expresión de un gen específico.       A 75 ratones divididos en 6 grupos de n=10 se les registró el peso corporal durante 3 días para tomar el promedio como su basal. En el día 1 a 4 grupos del total se los anestesió (ketamina/xilasina 90/10 mg/kg) e inyectó en el VI 50 uL de siRNA-TRH o siRNA-Con (5ug/ul). En el día 2, todos los grupos fueron inyectados ip. con D (200 ul,10 mg/kg ip.) o solución salina (SF). La dosis utilizada en estos experimentos fue la elegida luego de haber experimentado en forma preliminar con las dosis de 5-10-y 20 mg/kg sugeridas en la bibliografía. Se obtuvieron 6 grupos : D; SF; D+siRNA-TRH(sistema de TRH bloqueado); D+siRNA-Con (sistema de TRH intacto), SF+si-TRH (sistema de TRH bloqueado) y SF+siRNA-Con (sistema de TRH intacto). Los animales fueron sacrificados a las 48h, 96h y 7 días post inyección de D. Los tiempos elegidos se basaron en datos de otros autores que demuestran un  aumento agudo de apoptosis (24-48 hs) y  un efecto tardío con fibrosis e hipertrofia a partir del día 4 post D. En VI cuantificamos la expresión (PCR en tiempo real) del precursor de TRH (pTRH) y de  marcadores de daño BNP y BMHC (hipertrofia), colágeno III y I (fibrosis), Bax/Bcl2 y caspasa 3 (apoptosis). Grupos paralelos (n=3) fueron utilizados para estudios anatomopatológicos  y de inmunohistoquímica.   Observamos (fig.1A) un aumento (media + DS, ANOVA y Tukey t) de la expresión del pTRH en los 3 grupos con D que fue más marcado a los 7d. El aumento solo se observó en los grupos con el sistema de TRH intacto (TRH+), demostrando así la efectividad del bloqueo. El siRNA no tuvo efecto en los grupos que recibieron SF sugiriendo que el sistema de la TRH cardíaco en condiciones basales tendría un bajo turn-over. Estos resultados fueron confirmados por inmunohistoquimica utilizando un anticuerpo policlonal de TRH desarrollado y validado en nuestro laboratorio.   Evaluamos el índice apoptotico Bax(proapoptotico)/Bcl2(antiapoptotico), y no observamos cambios significativos a las 48 hs, solo una tendencia en los animales tratados con D y con el sistema intacto (TRH+), por el contrario a las 96 hs observamos un aumento significativo (que fue a expensas de un aumento de Bax) en ambos grupos tratados con D tanto con el sistema TRH intacto, como con el sistema bloqueado, sugiriendo que la apoptosis a las 96 hs no involucraría al sistema de  TRH, por lo menos en este modelo. Sin embargo, a 7d de tratamiento, se incrementó del índice de apoptosis inducido por D que fue  abolido cuando el sistema de la TRH se encuentra bloqueado.   Evaluamos  la expresión de caspasa 3, a las 48 hs hubo una tendencia de aumento en el grupo tratado con D y con el sistema intacto que llego a ser significativa a las 96 hs en el grupo D (TRH+). Sorprendentemente el       aumento que se había observado en el índice apoptotico en el grupo tratado con D (TRH -) no correlacionó con caspasa 3. Por el contrario, a los 7d, se observó una correlación directa entre el aumento del índice apoptotico y la caspasa 3 en los grupos tratados con D (TRH +) y D (TRH-), sugiriendo que la TRH podría estar involucrada solo en la vía apoptotica que involucra Bax/caspasa3.    Evaluamos B-MHC  ya que la cardiotoxiciocidad con D induce apoptosis y hipertrofia con fibrosis a tiempos mayores.  Observamos  un aumento muy importante (p<0.04) a las 96 hs en el grupo tratado con D TRH(+), aumento que no se observó en el grupo con la TRH inhibida D TRH(-). El aumento se mantuvo a los 7d aunque de menor magnitud, en donde parecería que se requiere del sistema de la TRH para la inducción del daño.   Nuestros resultados muestran la participación de la TRH cardíaca en la cardiotoxicidad inducida por doxorrubicina en el miocardio y que su bloqueo local mediante RNA de interferencia impide el desarrollo de apoptosis en la fase temprana y fibrosis a la semana, ubicando al sistema de  TRH como candidato de estudio en  la cardiotoxicidad de la D.