Study of the effect of hypotonic stimuli on mouse epithelial sodium channel (ENaC) in Xenopus oocytes oocytes.

GALIZIA L, PALMA A, MARINO GI, OJEA A, KOTSIAS BA

Congreso; Congreso Sociedad Argentina de Biofísica; 2013

Sociedad Argentina de Biofísica

El canal de sodio epitelial (ENaC) es fundamental en la homeostasis del medio interno y su regulación depende varias de hormonas, en especial la aldosterona, diversas proteasas, proteínas del citoesqueleto y su actividad depende de estímulos  mecánicos. El papel en la migración celular del ENaC se ha demostrado recientemente en células de músculo liso y glioblastoma. Los resultados previos de nuestro laboratorio en el estudio de ENaC muestran que el canal está presente en células de placenta y sugieren un papel en la migración en estas células. Los mecanismos que regulan la actividad de ENaC durante la migración son desconocidos. La íntima relación entre la migración y la actividad de los canales iónicos está dada por su respuesta ante los cambios de volumen. Durante el proceso de migración celular ocurren cambios de volumen provocados por el flujo de agua e iones. El objetivo de este trabajo es estudiar el comportamiento del canal ENaC en respuesta a  estímulos hipotónicos en el sistema de expresión heterólogo de ovocitos de Xenopus Laevis.  Se registraron las corrientes de sodio sensibles a amiloride INa (Amil) por la técnica de voltage-clamp. Los ovocitos inyectados con ENaC sometidos a gradientes hipotónicos del 25 % muestran una reducción significativa de las corrientes de sodio sensible a amiloride INa (Amil)  registradas a   ? 100 mV (de -10.6 ± 1.5 µA a -4.7 ± 0.8 µA n=13,  p <0.05). Esta disminución de las corrientes a través del ENaC del 50 % ocurre rápidamente, sugiriendo que el estímulo osmótico es capaz de modificar la apertura y cierre del canal.  Al analizar la cinética de inactivación de las corrientes, observamos que durante el tratamiento con hipotonía las corrientes  se inactivan más rápidamente. Esto indicaría un efecto en la probabilidad de apertura de los canales ENaC.  Para estudiar este mecanismo utilizamos una mutación de ENaC que se encuentra constitutivamente abierta (mutación DEG). Los ovocitos que expresan la mutante DEG  responden cambios de volumen del ovocito con una pequeña disminución en las corrientes INa (Amil) (12 ± 3 %; n=5); sin embargo esta inhibición es significativamente menor a la observada en los ovocitos que expresan ENaC salvaje (53 ± 5 %, n =12; p< 0.05). Por lo tanto, la mutación DEG inhibe la capacidad de ENaC de responder a  estímulos osmóticos.   Estudiamos la participación del citoesqueleto de actina en la inhibición del ENaC por estímulos hipotónicos. Observamos que tanto la disrupción a corto plazo (20 minutos) y a largo plazo (2-5 hs) con citocalasina D no afecta la inhibición de las corrientes de ENaC durante el estímulo hipotónico. Estos resultados sugieren que el canal ENaC expresado en el ovocito de Xenopus Laevis  es capaz de regular su  apertura  frente a cambios en la osmolaridad externa y esta regulación no dependerìa del citoesqueleto de actina.