Estudios Farmacocinéticos de una Nueva Prodroga de Zidovudina

QUEVEDO, M.A.; BRIÑÓN, M.C.

San Luis

Congreso; XXVI Congreso Argentino de Química; 2006

Asociación Química Argentina

ESTUDIOS FARMACOCINÉTICOS DE UNA NUEVA PRODROGA DE ZIDOVUDINA Mario A. Quevedo*; Margarita C. Briñón Departamento de Farmacia ? Facultad de Ciencias Químicas ? Universidad Nacional de Córdoba. Haya de la Torre esq. Medina Allende s/n ? Ciudad Universitaria ? 5000 ? Córdoba, Argentina. E-mail: alfredoq@mail.fcq.unc.edu.ar Introducción La zidovudina (AZT, 1, Figura 1) es una droga utilizada extensamente en el tratamiento de la infección causada por el virus HIV-1. Si bien su eficacia terapéutica ha sido ampliamente reconocida desde su aprobación por la FDA en 1986, diversos efectos adversos se encuentran asociados a su administración, los cuáles se encuentran fundamentalmente relacionados a su corto tiempo de vida medio plasmático (t1/2 »1 hora).1 Es así que en nuestro grupo de trabajo nos abocamos desde hace años al diseño y desarrollo que nuevas prodrogas de AZT que optimicen sus parámetros farmacocinéticos, y fundamentalmente que exhiban tiempos de vida media plasmáticos más prolongados. Es así, que en etapas previas se ha obtenido una nueva prodoga de AZT, denominada AZT-Ácido (2, Figura 1),2 sobre la cual se han realizado diversos tipos de estudios, presentándose en esta oportunidad aquellos correspondientes a las determinaciones farmacocinéticas realizadas. Para ello, se desarrolló y validó una metodología adecuada empleando al líder AZT, y luego se hizo extensiva al estudio del derivado 2, cuantificando diversos parámetros farmacocinéticos entre los que se encuentran: tiempo de vida media plasmático (t1/2), distribución entre plasma y componentes celulares de la sangre, volumen de distribución y clearance plasmático. Metodología Metodología a) Cuantificación: Se la realizó por HPLC con detección UV (267 nm) en un equipo Agilent 1100, empleando una columna Synergi 4 mm Fusion C18. La fase móvil utilizada fue una mezcla buffer fosfato pH 2:MeOH:THF (70:28:2), flujo 1 ml/min, y termostatizando a 40 °C. Se inyectaron 100 μl de solución. b) Procedimiento de extracción en fase sólida sobre las muestras a cuantificar: Una alícuota de plasma fue diluida con buffer fosfato pH 2. La solución homogeneizada fue aplicada sobre un cartucho de extracción Strata X (Phenomenex®) que se encontraba previamente acondicionado. La droga extraída fue eluída del cartucho utilizando una mezcla buffer fosfato pH 2 : acetonitrilo y preparada para su cuantificación por HPLC. Se validó la metodología estudiando la recuperación de droga desde plasma de rata en concentraciones de 15 y 49 mg/L, respectivamente. c) Determinación in vitro del tiempo de vida medio plasmático (t1/2): Se utilizó plasma fresco extraído de ratas Wistar. Se incubó el plasma a 37 °C, al cual se le adicionó una alícuota de la solución estándar de 2. Se tomaron muestras a distintos tiempos, las cuáles fueron sometidas al procedimiento de extracción en fase sólida y cuantificadas por HPLC. d) Distribución entre plasma y los componentes celulares de la sangre: Se utilizó sangre completa y heparinizada extraída de ratas Wistar. Se incubó la sangre a 37 °C, a la cual se le adicionó una alícuota de la solución estándar de 1 y de 2. Luego de 10 minutos de incubación se separó por centrifugación el plasma de los componentes celulares. Por un lado, el plasma obtenido fue sometido a la extracción en fase sólida y posterior cuantificación, y por otro, los componentes celulares fueron lisados por el agregado de buffer pH 2 y sonicación. Luego de la centrifugación a altas velocidades, el sobrenadante fue sometido a la extracción en fase sólida y posterior cuantificación. e) Determinación del perfil plasmático in vivo de 2: El procedimiento empleado fue previamente validado empleando la droga líder AZT.3 Se utilizaron ratas Wistar de 300-350 g anestesiadas con uretando i.p. (1000 mg/kg). Se canuló la vena femoral derecha y arteria femoral izquierda, administrando dosis de 2 (0,3 ml/20 mg/kg) y tomando muestras de sangre (0,15 ml) a 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100 y 120 min. Se centrifugaron las muestras y a 50 ml de plasma fueron sometidos a extracción en fase sólida y cuantificado por HPLC. Resultados a) Método cromatográfico: En las condiciones cromatográficas utilizadas se logró una buena resolución entre los componentes provenientes del plasma de rata, el AZT-Ácido y AZT. Los tiempos de retención fueron 7,43 y 5,91 minutos para 1 y 2, respectivamente. b) Procedimiento de extracción en fase sólida: Los ensayos de recuperación de 2 presentaron porcentajes de recuperación de 100,86 % (± 3,43, n = 3) y 95,71 (± 2,20, n=3) para concentraciones de 15 y 49 mg/L, respectivamente. La recuperación de 1 fue previamente validada.3 c) Tiempo de vida medio plasmático de 2 (método in vitro): se encontró que luego de 10 min de incubación a 37 ºC, el 86% de 2 se encontraba hidrolizado y presente como 1, mientras que tras 20 minutos de incubación el 100% de 2 se encontró hidrolizado y solo se detectó la presencia de 1. d) Distribución entre plasma y los componentes celulares de la sangre: Se determinó la relación de concentraciones de droga presente en plasma y el citoplasma de los componentes celulares sanguíneos (Concplasm/Conccel). La relación de concentraciones de 1 fue de 0,54 (± 0,06) y 0,95 (± 0,08) luego de la incubación de 1 y 2, respectivamente. e) Determinación del perfil plasmático in vivo y parámetros farmacocinéticos de 2: Luego de la administración de 20 mg/kg de 2 y del análisis de las correspondientes muestras biológicas, sólo pudo determinarse la presencia de 1 en plasma, el cual proviene de la hidrólisis de 2. Es así que se graficó el log conc. plasm. de 1 vs. tiempo, obteniéndose un perfil bilineal. Así se calcularon los siguientes parámetros farmacocinéticos para 1 tras la administración de 2: para la fase 1 (F-1): t1/2 = 1,36 (± 0,14) hs., volúmen de distribución = 0,71 (± 0,02) l/kg y Clearance Plasmático = 0,36 (± 0,01) l/h kg, mientras que para la fase 2 (F-2) los correspondientes parámetros fueron: t1/2 = 7,70 (± 1,54) hs., volúmen de distribución = 1,18 (± 0,17) l/kg y Clearance Plasmático = 0,11 (± 0,02) l/h kg. Conclusiones  En primer lugar puede concluirse que las condiciones cromatográficas establecidas permiten cuantificar tanto a 1 como a 2, desde una matriz plasmática. Se puede decir también que el procedimiento utilizado para la extracción en fase sólida es adecuado para extraer a 1 y a 2 en el rango de concentraciones ensayadas, ya que las recuperaciones de dichas drogas desde plasma de rata son cuantitativas. Respecto de los estudios de estabilidad in vitro de 2, se concluyó que esta droga es rápidamente atacada por esterasas plasmáticas, por lo que su tiempo de vida media no pudo ser determinado mediante la metodología empleada, ya que luego de 20 minutos de incubación su concentración había caído debajo del límite de detección. Por otra parte, y en base a los estudios de permeación en los componentes celulares sanguíneos, si bien no se detecta la presencia de 2 en el plasma o en el lisado celular, la presencia de 1 en dichos fluidos puede considerarse proporcional de la cantidad de 2 que alcanzó cada fluido antes de ser hidrolizado. Es así, que puede decirse que 2 tiene una capacidad de penetración celular significativamente menor que 1, y considerando que 2 se encuentra ionizado a pH plasmático, la dificultad para ingresar al interior celular puede explicarse por su menor solubilidad en las membranas lipídicas de las células sanguíneas. En base a las conclusiones arriba presentadas, queda claro que 2 es rápidamente hidrolizado dentro de los compartimentos intravasculares por acción de las esterasas plasmáticas. Ésta es la causa por la cual en el estudio del perfil plasmático in vivo, sólo se detecta la presencia de 1 en plasma. A pesar de ello, si se compara el perfil plasmático de 1 obtenido tras la administración de 1,3 y de 2, se observa que en el segundo caso se obtiene una eliminación de 1 en dos fases, siendo los parámetros farmacocinéticos de la F-1 equivalentes a los obtenidos luego de la administración de 1, mientras que los parámetros correspondientes a la F-2 indican una eliminación de 1 significativamente mas lenta. Estas observaciones traen como resultado que tras la administración de 20 mg/Kg de 2, las concentraciones plasmáticas de 1 se mantengan dentro de la ventana terapéutica (0,27 ? 16,00 mg/L)4 durante 20,33 hs, mientras que tras la administración de la misma dosis de 1, dichos valores se mantengan durante 3,45 hs. Es así que el período de efectividad de 1 sería 5,9 veces mas largo luego de la administración de nuestra nueva prodoga (2) que de la correspondiente droga líder (1). Se concluye que esta prolongación en el tiempo de vida media de AZT, responde a una acumulación de 2 en el espacio extravascular. Dicha acumulación se produciría como consecuencia de una afinidad diferenciada por la albúmina presente en el compartimento intravascular (acomplejada con ácidos grasos provenientes de la dieta [Alb-Ag])5, y la albúmina presente en los compartimentos extravasculares [Alb], en los cuáles la concentración de ácidos grasos es significativamente menor,6 por lo que puede considerarse que esta albúmina no se encuentra acomplejada con ácidos grasos. En este sentido, en trabajos anteriores se determinó que la fracción de 2 unida a [Alb-Ag] es 10,4 % (± 1,8), con una constante de afinidad de 811,7 L/mol, mientras que a [Alb] la fracción unida es de 47,0 % (± 0,4) con una constante de afinidad de 6.201,3 L/mol.7-8 Es así que el modelo bilineal hallado para AZT tras la administración de 2 se explicaría por los siguientes eventos: a) una fase inicial rápida en donde se administra 2 con simultánea distribución e hidrólisis para regenerar 1, b) una F-1, en donde se observa la eliminación de 1 regenerado en la fase inicial rápida y la equilibración del compartimento intravascular con el extravascular, y c) una F-2 en donde la hidrólisis de 2 y su posterior eliminación dependen del reingreso de 2 acumulado en el compartimento extravascular y por ende es proporcional a la inversa de la afinidad de 2 por [Alb].  El efecto de acumulación en el compartimento extravascular no es observado para 1, dado que éste exhibe mayor afinidad por [Alb-Ag] que [Alb]. La fracción de 1 unido a [Alb-Ag] es de 17,1 % (± 5,8) con una constante de afinidad de 1.442,5 L/mol, mientras que para [Alb] es de 12,1 %  (± 0,6) y una constante de afinidad de 1.044,9 L/mol.7-8 En base a todo lo expuesto, cabe destacar que AZT-Acido (2) es un promisorio candidato, sobre el cual se realizarán nuevos estudios farmacocinéticos relacionados con la administración por vía oral, algunos de los cuáles ya se han realizado para el líder AZT.9 Por otra parte, resulta de significativo interés elucidar las bases moleculares de la afinidad diferenciada de 1 y 2 por [Alb-Ag] y [Alb], ya que en ello podrían encontrarse los fundamentos para el diseño de nuevos derivados con parámetros farmacocinéticos optimizados y que prolonguen el t1/2 plasmático de AZT. En este sentido, se están realizando estudios computacionales de dinámica molecular sobre los correspondientes complejos, los que resultarán en un aporte fundamental a este fin.