Construcción y cinética de la replicación del genoma de la primera recombinante D/A del HBV detectada en el continente americano.

TRINKS J; SUGIYAMA M; KURBANOV F; TANAKA Y; BENETUCCI J; GIMENEZ E; MINASSIAN ML; ANDREETTA AM; MIZOKAMI M; OUBIÑA JR

Buenos Aires

Congreso; XVI Congreso Argentino de Hepatología.; 2011

Asociación Argentina para el Estudio de las Enfermedades del Hígado (AAEEH).

Introducción: El HBV ha sido clasificado -hasta el momento- en 9 genotipos (A-H y J) que difieren en su implicancia pronóstica y terapéutica. Si bien se han descripto genomas recombinantes del HBV, sus efectos en la clínica, el pronóstico y el tratamiento de la infección viral no han sido aún estudiados. En un estudio previo, nuestro grupo caracterizó el genoma completo de la primera recombinante D/A del continente americano en un individuo argentino coinfectado con HIV y HCV. Objetivos: Los objetivos del presente estudio fueron la construcción y determinación de la capacidad replicativa de dicho genoma D/A, en comparación a sus genotipos parentales (D y A) y al genotipo C. Materiales y Métodos: Se construyeron plásmidos pUC19 conteniendo 1,24 veces el genoma de HBV (replicones) de los genotipos A, C, D y de la recombinante D/A. Células Huh7 fueron transfectadas con dichos plásmidos y la eficiencia de la transfección fue establecida usando un vector GFP-pTARGET. Las células fueron lisadas a las 72 hs post-transfección para la extracción del ADN del HBV asociado a la proteína del core y posterior determinación de la eficiencia de replicación mediante Southern blot. A las 24 y 72 hs post-transfección, los niveles de ALT/AST, carga viral (COBAS TaqMan HBV Test, Roche), HBsAg y HBeAg (Abbott) fueron determinados en el medio de cultivo. Los experimentos fueron realizados por duplicado y se incluyeron controles negativos en todos ellos. Se utilizó el test t de Student para el análisis estadístico. Resultados: Todos los clones fueron capaces de replicar en las células Huh7 y secretar HBs y HBeAg. Aunque los niveles de replicación del ADN del clon D/A fueron más elevados que los de los replicones de los genotipos parentales, esta diferencia no fue estadísticamente significativa. A las 24 hs post-transfección, el replicón D/A presentó los niveles más elevados de ambos antígenos (p<0,05). A las 72 hs, el nivel de HBsAg del replicón C fue el más elevado, seguido por D/A que exhibió valores significativamente más altos que los de los clones parentales (p<0,01). En este punto, el replicón D/A produjo los niveles más elevados de HBeAg (similar al clon C). La eficiencia de transfección y la viabilidad celular -monitoreada por los niveles de ALT/AST- fueron similares en todos los grupos (p=NS). Los controles negativos no evidenciaron la presencia de DNA ni antígenos del HBV. Conclusiones: Se describe el primer reporte de la literatura internacional que demuestra la construcción de un clon de un genoma recombinante de HBV con competencia replicativa. La cinética de replicación de la recombinante D/A difiere de la de sus genotipos parentales, siendo similar a la del clon C. Se requieren futuros estudios in vivo para determinar la patogenicidad de los replicones construidos.