Produccion de anticuerpo policlonal anti-TAZ

ALDANA GOJANOVICH; UHART, MARINA; BUSTOS, DIEGO M

Congreso; XV Jornadas Anuales de la Sociedad Argentina de Biología; 2013

P { margin-bottom: 0.08in; direction: ltr; widows: 2; orphans: 2; } El co-activador/represor transcripcional TAZ (Transcriptional co-activator with PDZ-binding motif) y su parálogo YAP (Yes-associated protein) son efectores de la vía Hippo en mamíferos, importante reguladora del crecimiento de órganos. La fosforilación de TAZ provoca su reclutamiento en el citoplasma por unión a proteínas reguladoras 14-3-3, impidiendo su actividad nuclear. Los factores de transcripción Runx2 y PPAR , modulados por TAZ, conducen la diferenciación de células madre mesenquimales (MSCs) a osteoblastos y adipocitos, respectivamente. Con el objetivo de generar un anticuerpo policlonal anti-TAZ, se sub-clonó un fragmento de la secuencia amino-terminal de TAZ de ratón, correspondiente a 98 aminoácidos, en el vector de expresión pRSET-A corriente abajo de una etiqueta de histidina. Se expresó el péptido y se purificó en columna de Co+2 en condiciones desnaturalizantes. Se inmunizó un conejo con dicho péptido y se analizó el suero por: i) dot blot con el péptido purificado, ii) Western Blot (WB) de lisado total de células de ratón NIH-3T3-L1 y iii) Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) de las mismas células. Por dot blot se detectaron desde 25 ng de péptido. Mediante WB se observaron únicamente dos bandas, una mayoritaria correspondiente a la masa molecular de TAZ y otra, menos intensa, a la de YAP. Se detectó por IFI señal citoplasmática y nuclear. En conclusión, este anticuerpo detecta principalmente TAZ, en estado desnaturalizado (WB) y nativo (IFI). Será utilizado para detectar la localización sub-celular de TAZ endógena en experimentos de inhibición de las isoformas de 14-3-3 durante la diferenciación de MSCs a osteoblastos y adipocitos.