“Estudio comparativo de regiones variables y conservadas de la GP5 (ORF5) y de la proteína M (ORF6) entre 4 aislamientos argentinos de arteritis viral equina y la cepa de laboratorio Bucyrus”

METZ, G. E.; SERENA, M.S.; PANEI,C, J; DIAZ, S; ECHEVERRÍA,M. G.;

Valle Hermoso, Córdoba.

Congreso; XXVI Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2006

Sociedad Argentina de Virología

Antecedentes: El virus de Arteritis Equina, perteneciente a la familia Arteriviridae, ocasiona infecciones, en su mayoría subclínicas, aunque puede causar abortos y enfermedad respiratoria en adultos y neumonía en potrillos. Los ORF5 y ORF6 de su genoma codifican las proteínas de envoltura GP5 y M, respectivamente, cuya interacción es crítica para la infectividad y expresión de determinantes antigénicos del virus mediante la unión de puente disulfuro. La GP5 es la proteína más estudiada y contiene 3 regiones variables y 4 constantes (V1-V3 y C1-C4). Los primeros aislamientos en Argentina se realizaron en nuestro laboratorio entre los años 2001 (cepa LP01) y 2002 (cepas LP02/R, LP02/C y LP02/P). En estudios previos se analizó el fenotipo de los aislamientos, en primera instancia, por la técnica de virusneutralización. Luego se realizó un rastreo de la variabilidad de las secuencias codificantes de las proteínas M y GP5 por los métodos de PCR-RFLP y PCR-SSCP. Todas las cepas Argentinas presentaron un fenotipo de neutralización similar entre sí, y la cepa de referencia de origen americano (Bucyrus), fue neutralizada en menor medida. Los cuatro aislamientos argentinos y la cepa Bucyrus mostraron patrones de SSCP distintos, al igual que diferentes patrones de RFLP.Objetivo: Comparar las distintas regiones aminoacídicas de ambas proteínas M y GP5 de las cepas aisladas en nuestro laboratorio respecto a la cepa de referencia Bucyrus, utilizada desde el año 1980 como laboratorio oficial de Red SENASA y que ha sufrido numerosos pasajes en cultivos celulares. Materiales y métodos: Se realizaron RT-PCR de ambos ORFs parciales utilizando para proteína M (ORF6) primers M1 y M10 que flanquean una región conservada de 411 pb y para GP5 (ORF5) utilizamos los primers GL105 y GL673 que flanquean una región de 546 nucleótidos. Los productos del ORF6 fueron clonados en vector pCR Topo 2.1 y expresados en células Top10. La secuenciación se realizó utilizando primers universales M13. Para ORF5, se realizó secuenciación directa utilizando primers internos CR2 y EAV32. Ambas cadenas de cada amplicón de los ORF5 y 6 fueron secuenciadas utilizando los primers descriptos. El análisis de las secuencias se realizó con programas del Baylor College of Medicine.Resultados: En el análisis de nucleótidos del ORF 6 parcial observamos en las 5 cepas, 47 sustituciones totales (~11%) sin deleciones ni inserciones, traducidos a 10 cambios de aminoácidos. Todas conservan el residuo de cisteína en posición 8 responsable de la unión con la GP5. En el caso del ORF5, encontramos 90 sustituciones nucleotídicas totales (~17%) que involucraron 26 cambios de aminoácidos y una deleción de 6 nucleótidos (11300-11305) en la cepa Bucyrus en la región C1. La región V1 es la más variable en todas las cepas analizadas, contiene los sitios involucrados en la neutralización, y concentra el 57% de los cambios aminoacídicos. ConclusionesEntre ambas proteínas los cambios se evidencian en mayor proporción en la GP5 y sobre todo en la región V1, como se describe en trabajos de otros autores. Dentro de la región V1 los cambios se concentran en el sitio neutralizante C. Los sitios de glicosilación principal y variable están conservados en las 5 cepas. La deleción en la región C1 de la cepa Bucyrus coincide con la informada por otros autores en cepas con altos pasajes en cultivos celulares. Esta deleción de la cepa Bucyrus, podría ser responsable, junto con los cambios aminoacídicos en la región V1 de las diferencias antigénicas halladas respecto a las cepas Argentinas. Más aún teniendo en cuenta que las cepas Argentinas se agrupan con las cepas Europeas al comparar ambos ORFs