“Clonado y Expresión de la glicoproteína E de una cepa argentina de Pseudorrabia (Enfermedad de Aujeszky), en un sistema de Baculovirus”

ECHEVERRÍA, M.G; SERENA, M.S; METZ, G.E; MÓRTOLA, E.C.

Ciudad de Buenos Aires.

Congreso; VIII Congreso Argentino de Virología; 2005

Asociacion Argentina de Microbiologia/ Sociedad Argentina de Virologia

La Enfermedad de Aujeszky (EA, Pseudorrabia) es una enfermedad producida por un herpesvirus ampliamente difundida en el mundo que está siendo erradicada en los países más desarrollados. Para esta virosis se ha identificado a la gE como candidato a principal componente de una vacuna a subunidades y como componente de los reactivos para control de inmunización. A partir de 1998 el SENASA implementó una campaña de prevención y erradicación de la EA mediante el uso de una vacuna gE deleteada y ensayos serológicos específicos de control. Los reactivos utilizados hasta el 2001 eran de origen extranjero y sufrieron discontinuación debido a los problemas económicos ocurridos en ese año. La posibilidad de producirlos en nuestro país a partir de cepas autóctonas permitirá proveer de materia prima para el desarrollo de una potencial vacuna a subunidades y distintos test de diagnóstico que permitan discriminar entre animales vacunados e infectados naturalmente. La actividad biológica in vivo e in vitro de las proteínas antigénicas depende en gran medida de la glicosilación postranscripcional, proceso bioquímico que no ocurre en bacterias. La producción de antígenos virales recombinantes en células de insectos por clonado en báculovirus, es un método que ha alcanzado relevancia en la obtención de proteínas con actividad inmunogénica. Con el propósito de obtener la proteína recombinante, el gen de gE fue digerido con la endonucleasa de restricción MseI del plásmido original (pUC#7BamHI), obtenido con anterioridad en nuestro laboratorio por librería genómica de la cepa CL-15, y clonado en el sitio NdeI del vector de transferencia pGEM -5Zf (Promega). Así se obtuvo el plásmido pGEM-gE de 4777 pb, el que fue utilizado para la secuenciación de la gE.Posteriormente, el gen gE de 1780 bp fue digerido del construido vector pGEM con las enzimas de restricción EcoR V y Sac I y clonado en los mismos sitios en el vector de báculovirus pTriEx-1.1 (Novagen). Se verificó la correcta inserción por endonucleasas de restricción y PCR.Este vector de transferencia de báculovirus se utilizó para reemplazar el gen de polihedrina tipo AcNPV por un gen heterólogo, en este caso, el gen que codifica para la proteína gE. Para la generación del báculovirus recombinante, se cotransfectaron células de insectos Sf21 con el plásmido de transferencia y el ADN del báculovirus (BaculoGold – BD Biosciences) por la técnica de liposoma catiónico (Cellfectin Invitrogen). El aislamiento del clon recombinante para la proteína gE, se llevó a cabo en células Sf9 a partir del sobrenadante de cotransfección. La presencia de la proteína recombinante en el lisado de células Sf9 se confirmó mediante la técnica de western blot, donde la proteína gE ubicada en el rango de peso molecular esperado, reaccionó específicamente con sueros de cerdos naturalmente infectados, detectados positivos por virusneutralización. Este resultado nos permite inferir que la proteína expresada conserva los epitopes inmunogénicos. Conclusiones Este primer paso, en la expresión de la proteína recombinante gE en nuestro laboratorio y la consecuente producción en escala de la misma, abre el camino para el desarrollo de estudios no solo destinados al diagnóstico serológico diferencial de la infección y a la evaluación de nuevas vacunas, sino también podrá aportar las bases para el mejor entendimiento de la infección por este virus.