INVESTIGADORES
IBAÑEZ Lorena Itati
congresos y reuniones científicas
Título:
DISEÑO Y EXPRESIÓN DE UN INMUNOGENO BASADO EN LA HEMAGLUTININA DEL VIRUS DE INFLUENZA EQUINA
Autor/es:
CALDEVILLA CECILIA; PAREDES ROJAS YESICA; IBAÑEZ LORENA ITATÍ; MATTION NORA
Lugar:
Ciudad Autónoma de Buenos Aires
Reunión:
Congreso; Congreso Argentino de Microbiología; 2013
Resumen:
DISEÑO Y EXPRESIÓN DE UN INMUNOGENO BASADO EN LA
HEMAGLUTININA DEL VIRUS DE INFLUENZA EQUINA
Caldevilla C., Paredes Rojas Y., Ibañez I., Mattion N.
Introducción: la influenza equina (IE) es una enfermedad infecciosa
causada por el virus influenza tipo A. Este virus es altamente contagioso y la
IE es considerada como la enfermedad respiratoria de mayor importancia económica
en las poblaciones equinas. La hemaglutinina (HA) es la principal proteína de
la envoltura viral e induce
anticuerpos capaces de neutralizar la entrada del virus a la célula. Sin
embargo, debido a su alta variabilidad antigénica genera baja reactividad
cruzada. Trabajos recientes demuestran la existencia en la HA de epitopes
neutralizantes altamente conservados entre las distintas cepas de influenza
ubicados en la región del tallo de la proteína, especialmente en el dominio HA2,
y que pueden ser utilizados para mejorar la reactividad cruzada.
Objetivo: diseñar y generar una molécula que contenga solamente la
región del tallo de la HA equina, de manera de exponer el dominio conservado
HA2 que no se encuentra accesible en la proteína nativa. Expresar dicha
proteína y utilizarla como inmunógeno para determinar reactividad cruzada
contra diferentes cepas de virus equinos y utilizar la secuencia de nucleótidos
para generar una vacuna a ADN.
Materiales y Métodos: la secuencia que codifica para HA (H3N8)
(A/Equi/Argentina/93) optimizada para su expresión en E.coli, fue clonada en el vector pET22b. La inducción de la
expresión de la proteína se realizó a diferentes concentraciones de IPTG y fue
evaluada a distintos tiempos, temperaturas y medios de cultivo. La expresión en
las fracciones se analizó mediante SDS-PAGE y western blot. Por otro lado, la
secuencia fue subclonada en un vector para expresión en eucariotas que fue
transfectado en células HEK293 para posteriormente detectar su expresión
mediante western blot.
Resultados: Se demostró la expresión de una proteína de 33 KDa mediante SDS-PAGE y
luego su identidad fue confirmada por WB. El tiempo óptimo para la
expresión de la proteína fue entre las 3 y 7 h post inducción, no observándose
expresión luego de una inducción over night. La proteína recombinante se
obtuvo a partir de la fracción insoluble y los mayores niveles de expresión se
alcanzaron con el medio Terrific Broth, a 37°C. No se observaron diferencias en
los niveles de expresión a distintas concentraciones de IPTG. La expresión en
células eucariotas presentó varios problemas, que estarían relacionados con la
falta del dominio globular que dificulta su expresión.
Conclusiones: se
logró optimizar la expresión de la proteína
variando las condiciones de concentración de IPTG, tiempo de inducción,
temperatura y medio de cultivo. Para solucionar los problemas relacionados con
la falta de expresión de la proteína en células eucariotas se están probando
nuevas estrategias, como la generación de proteínas quiméricas que facilitarían
la expresión por formación de trímeros.