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Toxicidad del Zn y aplicación del Modelo del Ligando Biótico en el río Pilcomayo Lic. María Victoria Casaresa, Dra. Laura de Caboa, Ing. Rafael Seoane b,c , Ing. Oscar Natale b Cristian Weingadt d y Dra. Alicia F. de Iorio d a Museo Argentino de Ciencias Naturales Bernardino Rivadavia, Área Ecología, Av. Angel Gallardo 470 (C1405DJR), Buenos Aires, Argentina. b Instituto Nacional del Agua, Au. Ezeiza-Cañuelas Buenos Aires, Argentina. c Facultad de Ingeniería Universidad de Buenos Aires, Departamento de Hidráulica, Av. Las Heras 2214, (C1127AAR), Buenos Aires, Argentina. d Facultad de Agronomía, Universidad de Buenos Aires, Avenida San Martín 4453 (C1417DSE), Buenos Aires, Argentina. Palabras clave: Río Pilcomayo; Cinc; Cnesterodon decemmaculatus; BLM Eje temático: Ecotoxicología y Química Ambiental Introducción: El cinc, al igual que otros metales pesados, llega a los ecosistemas acuáticos como un subproducto de varios procesos industriales y la actividad minera. En la alta cuenca del Río Pilcomayo, la actividad minera en Potosí (Bolivia) comenzó en 1545 y ha llevado a una severa contaminación por metales pesados del agua y los sedimentos del río. Decenas de toneladas de desechos tóxicos son liberadas diariamente en el río. El cinc es un micronutriente esencial con una fisiología bien regulada. Utilizado por casi 200 enzimas (Linder, 1991 en Clifford y McGeer, 2009), en mamíferos y otros vertebrados superiores es absorbido a nivel intestinal, pero en peces existe otro importante órgano de absorción, las branquias. El cinc ejerce su efecto tóxico en los peces inhibiendo la absorción de calcio. Esta inhibición genera una desbalance entre la absorción y la perdida de calcio induciendo una perdida neta que resulta en una disminución de la concentración plasmática que conduce, eventualmente, a una hipocalcemia. Esta puede ser letal si concentraciones de cinc lo suficientemente elevadas se mantienen por periodos prolongados. El calcio y el cinc, en su forma iónica libre (Zn2+), compiten por el mismo canal iónico, de forma tal que mientras elevados niveles de cinc inhiben la absorción de calcio, lo opuesto es también verdadero. Existe una variedad de factores químicos que pueden ejercer un efecto protector sobre la unión del metal a los sitios de acción de toxicidad, ya sea por competencia catiónica (calcio, magnesio, sodio, protones), o por complejación aniónica (ion hidróxido, carbonato y bicarbonato, cloruro, tiosulfato, sulfuros, y principalmente carbono orgánico disuelto), previniendo, de ese modo, la unión del metal a los sitios de toxicidad. Particularmente, la interacción entre el calcio y el cinc explica el importante efecto que la dureza tiene sobre la toxicidad del cinc (Clifford y McGeer, 2009). El Modelo del Ligando Biótico (MLB ó BLM, en inglés) es, básicamente, un modelo de equilibrio químico cuyo marco conceptual puede ser considerado en términos de tres componentes. Un componente involucra la química del agua, que permite predecir la concentración del ion metálico libre. Un segundo componente involucra la unión del metal tóxico al ligando biótico, y el último componente constituye la relación entre el metal unido al ligando biótico y la respuesta tóxica. El ?ligando biótico? representa el sitio de acción de la toxicidad, donde la unión del metal tiene como consecuencia la manifestación de un efecto tóxico (Paquin et al., 2002). Hasta el momento, el BLM ha sido desarrollado para dos especies de peces: el cabezón (Pimephlales promelas) y la trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss), tres especies de invertebrados: Daphnia magna, Daphnia pulex y Ceriodaphnia dubia y cuatro metales: cobre, cinc, plata y cadmio. Implícitamente se asume que el BLM podría extrapolarse entre grupos taxonómicos similares ya que los parámetros que describen la interacción entre los cationes (principalmente calcio, magnesio y protones), el ion metálico libre (en este caso, Zn2+) y el ligando biótico sería similar entre organismos (Schlekat et al., 2010). Cnesterodon decemmaculatus (Pisces: Poeciliidae; Jenyns, 1842) es una especie endémica de la familia Poeciliidae con una extensa distribución en América neotropical. Alcanza elevadas densidades en una amplia variedad de cuerpos de agua dentro de la cuenca del Plata. C. decemmaculatus es pequeña, vivípara, microomnivora, bento-pelágica y no migratoria. Fácil de criar en laboratorio, resulta adecuada como organismo experimental. Pimephales promelas (Pisces: Cyprinidae; Rafinesque, 1820) es una especie holártica, de clima templado. La EPA ha indicado su uso para evaluar la toxicidad aguda y crónica de muestras de agua o de especies químicas. Al igual que C. decemmacultus, se la encuentra en cuerpos de agua turbios, poco oxigenados, charcas y arroyos inhóspitos para otras especies. Objetivos: Objetivo general Evaluar una posible extrapolación interespecífica del BLM para el cinc en aguas del río Pilcomayo. Objetivos específicos: determinar la toxicidad del cinc, es decir, la concentración letal media (CL50) a 96 horas para C. decemmaculatus en agua del río Pilcomayo, aplicar la versión 2.2.3 del BLM para predecir el valor de CL50 del cinc para P. promelas en agua del río Pilcomayo y comparar el valor de CL50 predicho por el modelo para P. promelas con el determinado experimentalmente para C. decemmaculatus. Materiales y métodos: El río Pilcomayo es un tributario de la gran Cuenca del Plata. Tiene sus nacientes en los Andes centrales de Bolivia a 5.200 msm. Su longitud total es de 2.426 km y la cuenca cubre 288.360 km2 (Comisión Trinacional del Río Pilcomayo). Las muestras para los análisis químicos y realización del ensayo de toxicidad se obtuvieron desde el Puente internacional en Misión La Paz, Salta (22º 22′ 45? S ? 62º 31′ 08? W) en Mayo del año 2009. El caudal (Q) fue medido por EVARSA-Argentina y el pH y la temperatura (T) se determinaron in situ. La concentración de calcio (Ca), magnesio (Mg), cloruros (Cl), potasio (K), sodio (Na) y sulfatos disueltos (SO4), la alcalinidad (Alc), la concentración de carbono orgánico disuelto (COD), de sólidos en suspensión totales (SST), de sólidos disueltos totales (SDT) y de cinc disuelto (Zn D.) se determinaron según protocolos de Standard Methods (APHA AWWA WEF, 2000). El agua utilizada en el ensayo de toxicidad fue centrifugada y filtrada. La concentración de cinc disuelto en el agua del río era de 0,13 μg Zn L-1. Juveniles de la especie Cnesterodon decemmaculatus fueron recolectados de una cava localizada en la Reserva Natural Los Robles, Provincia de Buenos Aires. Se mantuvieron en agua declorada durante 30 días y luego fueron aclimatados al agua y temperatura del ensayo. Se llevó a cabo un ensayo de toxicidad aguda a 96 horas en sistemas estáticos (acuarios) con aireación artificial continua, temperatura constante y fotoperiodo natural del laboratorio. El volumen de agua del ensayo en cada acuario fue de 2 L. El diseño experimental incluyó 5 concentraciones de cinc y un grupo control (agua del ensayo sin el agregado de metal). Las concentraciones de cinc ensayadas fueron: 3,74; 9,2; 14,00; 21,6 y 26,4 mg Zn L-1. Estos valores corresponden a mediciones de metal al inicio del ensayo. La longitud media estándar de los individuos seleccionados fue de 21,1mm y cada acuario contenía 10 peces. Se realizaron observaciones 4 veces por día para determinar mortalidad y diariamente se midió temperatura, pH, conductividad y oxígeno disuelto. De cada acuario se tomaron muestras de agua para determinar la concentración de cinc disuelto mediante espectrofotometría de absorción atómica previa digestión ácida (HNO3:HClO4:HF:HCl). La concentración letal media (CL50) a 96 h fue calculada aplicando el método PROBIT. La versión 2.2.3 del BLM para Windows (disponible en http://www.hydroqual.com/wr_blm.html) se aplicó para predecir el valor de CL50 del cinc para P. promelas. Los parámetros de calidad de agua aplicados en el BLM fueron: temperatura, pH, carbono orgánico disuelto, calcio, magnesio, sodio, potasio, sulfatos, cloruros, alcalinidad y concentración de cinc disuelto en el agua del ensayo (Di Toro et al., 2001). Se aplicó el programa de equilibrio químico MINEQL+ (Schecher y McAvoy, 1992) para determinar la especiación del cinc en cada una de las concentraciones ensayadas. Resultados: En la tabla 1 figuran las principales variables físico-químicas del agua del ensayo. No se produjo mortalidad en el grupo control. El CL50 a 96 horas predicho por el BLM para P. promelas en agua del río Pilcomayo fue de 1,71 mg Zn L-1 y el determinado experimentalmente con[x1] su respectivo intervalo de confianza fue de 22,46 (17,98-31,69) mg Zn L-1. Este valor se determinó a partir de las concentraciones de cinc disuelto medidas al inicio del ensayo. La formación de un precipitado se observó a las pocas horas de iniciado el ensayo. La especiación predicha por el modelo MINEQL+ para cada una de las concentraciones iniciales medidas indica que un elevado porcentaje del metal se encontraría precipitado como carbonato de cinc monohidratado (ZnCO3.1H2O) (figura 1). Tabla 1. Variables físico-químicas del agua del Río Pilcomayo.La temperatura y pH son los valores medios del ensayo. Parámetros T º C 16,6 pH UpH 7,9 COD mg L-1 4,4 SO4 mg L-1 207,3 Ca mg L-1 73,3 Mg mg L-1 30,5 Cl mg L-1 101 Na mg L-1 65,2 K mg L-1 5,1 Alc mg L-1 CaCO3 110 Zn D. mg L-1 0,0007 SST mg L-1 1637 SDT mg L-1 517 Figura 1. Especiación predicha [x2] por el MINEQL+ para las concentraciones iniciales de cinc ensayadas y el control. La fórmula ZnCO3.1H2O hace referencia a la especie de cinc precipitada y ?Zn disuelto? se refiere a todas las especies de cinc que permanecen en solución. 4. Discusión y conclusiones La formación de complejos entre el ion libre y los ligandos orgánicos y/o inorgánicos presentes en el agua constituye uno de los factores que reduce la biodisponibilidad del metal y, por lo tanto, la toxicidad. En este estudio la formación de la especie ZnCO3.1H2O ha sido muy importante, reduciendo en más del 50 % la fracción de cinc disuelto en todas las concentraciones ensayadas. En los casos en los que se ha observado el metal precipitado en suspensión (Santore et al., 2002) los valores de CL50, como en el presente estudio, difieren de los determinados por el BLM, el cual sobrestimaría la toxicidad del cinc. Por otro lado, el valor de CL50 calculado a partir de las concentraciones disueltas de cinc predichas [x3] por el MINEQL+ para cada una de las concentraciones iniciales medidas es de 1,54 mg Zn L-1 (1,51-1,60). Si se considera este valor como el CL50 determinado experimentalmente, el valor predicho por el BLM es preciso, es decir, una extrapolación sería válida para los parámetros de calidad de agua del Río Pilcomayo y condiciones de este ensayo (figura 2). Aún así, en los casos en los que se observó el metal precipitado también sería posible atribuir la mortalidad observada al factor de que los peces estuvieron en contacto, al menos durante los primeros minutos u horas del ensayo, con la totalidad del cinc disuelto. Figura 2. Concentración letal media predicha [x4] (CL 96 h) por el BLM para P. promelas versus concentración letal media medida para C. decemmaculatus en agua del Río Pilcomayo para la fracción disuelta. La línea diagonal de mayor grosor representa una concordancia exacta entre los valores medido y estimado y las líneas más delgadas representan un factor de más menos 2. Los complejos formados que permanecen en suspensión también podrían resultar tóxicos. Everall et al., (1989), hallaron un aumento de la toxicidad del cinc en la trucha marrón (Salmo trutta) en el rango de pH de 7 a 9. Los autores atribuyen ese aumento a la fijación del metal precipitado al mucus y capas epiteliales de las branquias. En adición al daño directo sobre el tejido, este proceso llevaría a la acumulación local del metal en la superficie branquial. El menor pH en el microambiente de las branquias, dado por la liberación de dióxido de carbono, podría facilitar la liberación del metal de las especies precipitadas favoreciendo así su acumulación. Bradley y Sprague (1985) concluyeron que la toxicidad de las especies carbonadas de cinc precipitado sería mucho menor a la producida por el ion libre. El agua del río Pilcomayo se caracteriza por su elevada concentración de sulfatos, cloruros, calcio y magnesio. Everall et al. (1989) y Judy y Davies (1979) han demostrado el efecto protector de elevadas concentraciones de calcio respecto a la toxicidad del cinc en P. promelas. Gómez et al. (1998) han determinado la toxicidad del cinc en C. decemmaculatus en aguas con distinta composición iónica. En agua del estuario del Río de La Plata, agua de una dureza de 103,5 mg L-1 CaCO3, alcalinidad de 207 mg L-1 CaCO3 y pH de 7,9 (igual al del presente ensayo), obtuvieron un CL50 a 96 h de 29,35 mg L-1. Dado que la concentración de calcio es mayor en el Río Pilcomayo, se esperaría una menor toxicidad del cinc en agua de este río respecto del Río de La Plata. Si se aplica el MINEQL+ al valor de CL50 para el Río de La Plata, el modelo predice que un 98% del cinc se encontraría precipitado como ZnCO3.1H2O, quedando 0,58 mg L-1 como cinc disuelto. Este valor, inferior al obtenido para el agua del Río Pilcomayo, podría estar reflejando el efecto protector de la mayor dureza del agua de este último río. El BLM ha predicho, en forma precisa, la toxicidad del cinc para la trucha arcoiris (Rainbow trout) a pH<9 y para larvas de P. promelas en aguas con elevadas concentraciones de materia orgánica (Bringolf et al., 2006). Los resultados del presente estudio indican que una extrapolación interespecífica del BLM para el cinc sería posible considerando la fracción disuelta del metal y no teniendo en cuenta la potencial toxicidad de la fracción precipitada. Para corroborarlo, es necesario realizar un ensayo con concentraciones de cinc similares a la estimada por el modelo. Referencias: (APHA, AWWA, WEF) American Public Health Association, American Water Works Association, Water Environment Federation 2000. Standard Methods for the examination of water and wastewater. 20sth ed. Washington DC: APHA, AWWA, WEF. Bradley R.M., Sprague J.B., 1985. The influence of pH, water hardness and alkalinity on the acute lethality of zinc to rainbow trout (Salmo gairdneri). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Science 42, 731-736. Bringolf R.B., Morris B. A., Boese C. J., Santore R. C., Allen H. E., Meyer J. S., 2006. Influence of Dissolved Organic Matter on Acute Toxicity of Zinc to Larval Fathead Minnows (Pimephales promelas). Arch. Environ. Contam. Toxicol. 51, 438?444. Clifford M., McGeer J. C., 2009. Development of a biotic ligand model for the acute toxicity of zinc to Daphnia pulex in soft waters. Aquatic Toxicology 91, 26-32. Di Toro D.M., Allen H.E., Bergman H.L., Meyer, J.S., Paquin P.R., Santore R.C., 2001. A biotic ligand model of the acute toxicity of metals I. Technical basis. Environ. Toxicol. Chem. 20, 2383?2396. Gómez S., Villar C., Bonetto C., 1998. Zinc toxicity in the fish Cnesterodon decemmaculatus in the Paraná River and Río de La Plata Estuary. Environmental Pollution 99, 159-165. Paquin P.R., Gorsuch, J.W., Apte, S., Batley G.E., Bowles K.C., Campbell P.G.C., Delos C. G., Di Toro D.M., Dwyer R.L., Galvez F., Gensemer R.W., Goss G.G., Hogstrand C., Janssen C.R., McGeer J.C., Naddy R.B., Playle R.C., Santore R.C., Schneider U., Stubblefield W. A., Wood C.M, Wu K.B., 2002. The biotic ligand model: a historical overview. Comp. Biochem. and Physiol. C 133, 3?35. Santore R.C., Mathew R., Paquin P.R., DiToro D., 2002. Application of the bitic ligand model to predicting zinc toxicity to rainbow trout, fathead minnows and Daphnia magna. Comp. Biochem and Physiol Part C 133, 271-285. Schecher W., McAvoy D., 1992. MINEQL: a chemical equilibrium program for personal computers. Environmental Research Software, Edgewater, U.S.A. Schlekat E.C, Van Genderen E., De Schamphelaere K.A.C., Antunes P.M.C., Rogevich E.C., Stubblefield W.A., 2010. Cross-species extrapolation of chronic nickel Biotic Ligand Model. Sci. Total Envir

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