Detección múltiple de virus patógenos de abejas (Apis melífera) de Argentina por reacción en cadena de la polimerasa.

SGUAZZA G. H.; REYNALDI F. J.; ALBICORO FJ; FUENTEALBA N.; PECORARO M.I.R.; GALOSI M.C.

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Jornada; Reunión Científico Técnica de la AAVDL; 2012

AAVDL

INTRODUCCIÓN La apicultura es una de las actividades agrícolas más importantes de la República Argentina y representa para el país un ingreso promedio anual de unos 100 millones de dólares provenientes de la explotación de más de 3.500.000 colmenas. El estado sanitario de las abejas depende de la interacción de diversos factores ambientales, del manejo de las mismas y de un gran número de microorganismos capaces de infectarlas, entre ellos los virus, que en los últimos años se han convertido en uno de los mayores problemas a los que se debe enfrentar la producción apícola (1, 2). Hasta el momento, han sido reportados al menos 18 virus distintos capaces de infectar a las abejas, la mayoría de ellos comprendidos dentro del grupo de los Picorna-like virus. Estudios previos realizados en nuestro país ya han evidenciado la presencia de varios de estos virus (3,4). OBJETIVO El objetivo de este trabajo fue desarrollar una técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa de tipo multiplex (m-PCR) que fuera capaz de lograr la detección simultánea de las principales virosis que afectan a las abejas: el Virus Israel de la Parálisis Aguda (IAPV), el Virus de las Alas deformadas (DWV), el Virus de la Parálisis Crónica (CBPV), el Virus de la Cría Ensacada (SBV), el Virus de las Celdas Reales Negras (BQCV) y el Virus de la Parálisis Aguda (ABPV). Materiales y Métodos Se recolectaron 235 muestras provenientes de diferentes apiarios de regiones apícolas más importantes de la República Argentina. Quince abejas tomadas al azar de cada una de estas muestras fueron homogeneizadas con 2 ml de solución tamponada de fosfatos (PBS) y clarificadas por centrifugación durante 15 minutos a 2500 g. Posteriormente se procedió a la extracción del ARN total a partir del sobrenadante obtenido, con Trizol y Cloroformo. El ARN se precipitó con isopropanol y luego se resuspendió en 50µl de agua libre de nucleasas. A partir de este ARN, se sintetizó el cDNA complementario por retrotranscripcion con la enzima MMLV, que posteriormente fue utilizado como molde para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos para cada uno de los virus previamente mencionado. La amplificación se llevó a cabo usando un volumen final de 25 µl, conteniendo una concentración final de: 75 mM Tris-HCl (pH 8.8), 20 mM (NH4)2SO4, 0.01% Tween 20, 200μM de cada dNTP, 1.5μM de MgCl2, 0.5 μM de cada primer, 2.5U de Taq DNA polimerasa y 5 µl de muestra. La electroforesis se realizó en geles de agarosa al 2,5%, utilizando un marcador de peso molecular de 100 pares de bases. Resultados Se confirmó la especificidad de cada par de primers por separado (Figura 1). Del análisis de los resultados se observó una frecuencia de aparición de 8,1% de ABPV, 12, 1 % de CBPV, 13,8% de SBV, 37,2% de DWV, 3,8% de BQCV y 42,9% de IAPV. Se detectaron co-infecciones con cuatro virus (ABPV, SBV, DWV y IAPV) en una muestra y con tres virus en tres muestras: dos con SBV, DWV y IAPV y una con CBPV, SBV y DWV (Figura 2). Finalmente se hallaron 29 muestras infectadas con dos virus en diversas combinaciones aunque en la mayoría de los casos (17 muestras) se halló la asociación IAPV y DWV. Conclusiones Con estos resultados se amplían los conocimientos relacionados a las enfermedades virales que afectan la producción apícola. Además se dejó en evidencia la presencia de infecciones múltiples dentro de los colmenares de la RA. Es importante destacar que el alto porcentaje de IAPV hallado, aun en colmenas asintomáticas, podría constituir un serio problema de producción ya que este virus ha sido relacionado con el Síndrome de Despoblamiento de Colmenas. Con otros estudios ya en desarrollo se determinará el verdadero impacto sanitario que tienen estos virus y podrán generarse medidas de control con el fin de evitar pérdidas económicas en la producción.