El contenido y la actividad DAGK de una fracción nuclear de fotorreceptores, altamente purificada, son modulados por la exposición de las retinas a la luz.

NATALINI, P.; ZULIÁN, S.; ILINCHETA DE BOSCHERO, M.G.; GIUSTO, N.M.

Buenos Aires

Jornada; V Jornadas de Bioquímica y Biología Molecular de Lípidos y Lipoproteínas; 2012

Los objetivos fueron, a) obtener una fracción nuclear purificada, proveniente de las células fotorreceptoras de la retina bovina, y b) determinar si la actividad y el contenido de isoformas de la diacilglicerol quinasa (DAGK) en dicha fracción son modificados por la luz. Los ojos bovinos fueron adaptados durante 2 h a oscuridad y las copas fueron expuestas durante 30 minutos a la luz o a la oscuridad. Para purificar la fracción se modificó un método de fraccionamiento por ultracentrifugación en gradientes discontínuos de sacarosa utilizado para SNC. Las retinas  fueron homogenizadas en sacarosa 0.25 M y combinadas con sacarosa 2.3 M para obtener un homogenado 1.6 M, el cual fue sembrado encima de sacarosa 2.3M, sobre una capa de 2.5M y centrifugado 70 minutos a 25000 rpm. Se obtuvo un pellet altamente purificado en núcleos de células fotorreceptoras (FNF). La pureza se corroboró por microscopía, electrónica (MET) e inmunofluorescencia (IF). La actividad DAGK en los núcleos de FNF fue detectada midiendo la formación de PA y empleando ATPg32P  y  dioleoilglicerol (DOG) como sustratos. Los resultados mostraron que la actividad aumenta en función del tiempo y de la concentración de proteínas. Las condiciones de saturabilidad para ATP y DOG también fueron medidas. Mediante WB fueron detectadas las isoformas épsilon y dzeta con predominio de la primera de ellas. Cuando se analizó el efecto de la luz sobre dichas isoformas, se  observó que mientras se halla un aumento de la actividad y el contenido de la DAGK dzeta, disminuye la actividad y expresión nuclear de la isoforma epsilon. Este hallazgo sugiere que la luz produce a nivel nuclear una disminución relativa en la capacidad de remoción de DAGs poliinsaturados frente a la de especies monoinsaturadas.