Identificación y caracterización estructural de los lípidos nitrados en muestras biológicas

BONACCI G

Los Cocos, Cordoba

Congreso; Primer congreso Argentino de Espectrometría de masas.; 2012

Organizado por la Sociedad Argentina de Espectrometría de Masa (SAEM).

La nitración de lípidos es el resultado de la reacción entre ácidos grasos insaturados con derivados del oxido nítrico y/o nitrito. Los ácidos grasos nitrados o nitroalquenos son potentes electrófilos que traducen sus acciones biológicas a través de la reacción de Michael con amino ácidos nucleofílicos presentes en proteínas regulatorias del metabolismo celular (1). La reactividad de la molécula está determinada por la presencia del grupo nitro (NO2) sobre el doble enlace (C=C) del alqueno, el cual convierte al carbono  en electrófilo. En estudios previos demostramos la formación de nitroalquenos en un modelo murino de isquemia y reperfusión cardiaca; sin embargo, la completa caracterización estructural de las especies formadas aun permanece sin dilucidar. El presente trabajo tiene como objetivo la caracterización estructural e identificación de los nitroalquenos endógenos. Para ello, se desarrollaron dos estrategias experimentales utilizando como herramienta a la espectrometría de masa; la primera estrategia explora la fragmentación de los nitroalquenos por técnicas de disociación inducida por colisión (CID) (2); mientras que la segunda estrategia analiza la fragmentación de los aductos [nitroalqueno-litio]+ en modo positivo (3). El espectro de masa (ESI-MS) en modo negativo de los ácidos grasos nitrados exhibe una fragmentación caracterizada por la pérdida de 1 o 2 moléculas de H2O, y la perdida aniónica (m/z 46, NO2-) y neutra (m/z 47, NO2H) del grupo nitro, utilizando energía de colisión (CE) de 35eV. Si bien la perdida del grupo nitro es indicativo de nitración, estos datos carecen de información estructural útil para diferenciar los numerosos isómeros posicionales y geométricos de los ácidos grasos insaturados, particularmente el ácido linoleico (LA; m/z 279) de los conjugados del ácido linoleico (CLA; m/z 279). El análisis por CID utilizando CE inferiores a 20eV mostró patrones de fragmentación diferenciales dependiendo de los ácidos grasos nitrados investigados. El análisis de las muestras de mitocondria tratadas con nitrito permitió identificar a los conjugados del acido linoleico y sus isómeros posicionales como el substrato preferencial de nitración endógeno (m/z 324; NO2-CLA). Estos resultados fueron corroborados analizando la fragmentación de los ácidos grasos nitrados co-infundidos con acetato de litio. La formación del aducto [M-Li]+ (m/z 332) bloquea la carga del grupo carboxílico en el ácido graso favoreciendo la fragmentación del ion en la doble unión C=C que contiene el grupo nitro (-NO2). De esta manera, el espectro de masa de las muestras biológicas mostró con mayor intensidad a los iones con m/z 192 y 205 provenientes del ion padre m/z 332 (18:2), estos iones se corresponden con productos de nitración en posición 9 y 12 sugiriendo un ácido graso con doble uniones conjugadas. Cuando se analizó la fragmentación del NO2-LA sintético (m/z 332) se obtuvieron iones con m/z 192 y 219, correspondiente con la nitración en el carbono 9 y 13 de la conformación bis-alílica del ácido graso. El conjunto de estos resultados, con la ayuda de los estándares sintéticos (isótopos 13C y 15NO2-), nos permitió confirmar al NO2-CLA como la especie de formación endógena sobre la posible nitración de otros ácidos grasos insaturados presentes en alta concentración como el ácido oleico o linoleico.