Fluorescence microcell device for molecular diffusion studies through nanoporous membranes

SILVIA SOTO ESPINOSA; MARIANO GRASSELLI

Buenos Aires

Simposio; XL Reunión Anual Sociedad Argentina de Biofísica; 2011

Sociedad Argentina de Biofísica

Los sistemas comúnmente utilizados en los estudios de difusión requieren cantidades considerable de muestra, mililitros, para poder cuantificar. También necesitan, es factor crítico, mantener el sistema bajo constante agitación, a fin de asegurar la homogeneidad del mismo. Nosotros proponemos el uso de un simple dispositivo (Microceldas) que pueden adaptarse al Nanodrop® 3300 (fluorometro) para medir fluorescencia in situ de las moléculas que difunde a través de una membrana polimérica. El dispositivo esta compuesto por dos cilindros, de acrílico, huecos (los huecos constituyen la cavidad de las celdas dadora y receptora respectivamente). Los cilindros se disponen encimados entre si: el cilindro inferior es transparente, mientras que el superior es de color negro para evitar la excitación por luz UV de la celda reservorio. El volumen total de cada celda esta en el rango de 10 a 20 microlitros y el diámetro del hueco es de 3mm. Utilizamos: membranas, de Policarbonato comerciales realizadas mediante el uso de trazas nucleares, provistas por SPI, de 10, 30 y 80 nm y con una fluencia de poros por centímetro cuadrado de 6x108 para las dos primeras y 4x108 para la ultima. Y fluoresceína y GFP (Green Fluorescent Protein) como moléculas de alto y bajo peso molecular. En todos los ensayos ajustamos la concentración inicial de fluorescencia a 20.000 RFU. Las curvas de difusión obtenidas con fluoresceína y GFP, para las membranas de 10, 30 y 80 nm de diámetro de poro, muestran que hay una relación directa entre la velocidad de difusión y el tamaño de poro. También se observa que la velocidad de difusión, pendientes de la curva, es proporcional a la concentración inicial y inversamente proporcional al tamaño molecular. Este simple dispositivo puede ser una herramienta útil para el estudio biofísico de moléculas complejas, macromoléculas y también para la caracterización de materiales nanoporosos, dado el bajo volumen de muestra y área de membrana que se requiere.