Desarrollo de un método para cuantificar Citomegalovirus (CMV) por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en tiempo real en pacientes adultos sometidos a Transplante de Células Hematopoyéticas Alogénicas (TCHA)

PÉREZ, F; BARIDON, A; VENEGONI, G ; BIEDMA, M.E; CIFUENTE, J; GOMEZ, RM; ROMANOWSKI, V; GUERRINI, G; CALMAGGI, A

Buenos Aires

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología; 2008

La infección por CMV, es una complicación frecuente con alto índice de morbi-mortalidad en pacientes sometidos a TCHA, para la cual existe tratamiento. De ahí, la necesidad de contar con técnicas tanto para su diagnóstico temprano como para su seguimiento a través de la cuantificación de la carga viral en el paciente.Nuestro trabajo se ha centrado en la aplicación y desarrollo de diversos protocolos de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) y el análisis comparativo con otras técnicas, para el diagnóstico temprano y el seguimiento, cuyos destinatarios son pacientes de la unidad de transplante de medula ósea (UTMO-CUCAIBA) del Hospital R. Rossi de La Plata, Buenos Aires.Brevemente, la técnica consistió en el aislamiento de  polimorfonuclerares mediante el uso de Dextran a partir de 5ml de sangre de paciente. Luego de estandarizar la muestra a 2000 celulas/µl, de la que se tomaron 1x106 celulas (500µl), para la subsiguiente extracción de ADN total utilizando un kit comercial. Del eluato de 50 µl obtenido, se tomaron 4 µl para cada determinación por qPCR, usando SYBR Green Master Mix 2X (Qiagen o Epicentre) y 0.25 mM final de cada primer en un volumen final de reacción de 25 µl. Previamente, se analizaron 5 pares de primers publicados por otros  con el objetivo de seleccionar el mejor candidato para diagnóstico evaluando la eficiencia de reacción, reproducibilidad, pico de melting, dimeros de primer, etc. Determinaciones por triplicado de muestra, blancos y estándares fueron testeados en cada corrida. Las curvas estándar fueron realizadas con ADN de cepa Towne entre 10 y 106 copias/µl. El ADN viral fue previamente cuantificado por qPCR versus un plásmido cuantificado espectrofotométricamente (patrón primario) el cual contiene clonado el fragmento de PCR de interés. Inicialmente los amplicones se chequearon también por electroforesis en gel de agarosa al 2%. Las amplificaciones fueron realizadas en dos cicladores diferentes de tiempo real (Bio-Rad y Bioer) y se contrastaron con PCR nested sobre las mismas muestras.Se analizaron 329 muestras provenientes de pacientes sometidos a TCHA, de las cuales el 20% resultaron positivas. El seguimiento se realizó semanalmente desde la infusión por un período mínimo de 3 meses. Los resultados de los pacientes se informaron como positivos o negativos de acuerdo a la presencia o ausencia del pico de melting correspondiente en al menos 2 de las 3 determinaciones realizadas sobre cada muestra. La cuantificación se llevó a cabo de acuerdo a la curva estándar, y se informó como cantidad de equivalentes genómicos/1.000.000 células.La enfermedad de base más frecuente fue la leucemia mieloide cronica  (30%). La serología pretransplante para CMV fue positiva en el 100% de los pacientes.Nuestro trabajo muestra que esta técnica de qPCR es de utilidad diagnóstica y de seguimiento de CMV en pacientes TMO, al ser un método rápido y reproducible hasta 1000 equivalentes genómicos/106 Células. Por otro lado esto mismo nos abre la posibilidad de estandarizar valores de corte para la evaluación de tratamientos y pronósticos como perspectiva de futuros trabajos.