Clonado del gen ie-1 del granulovirus de Epinotia Aporema (EpapGV) y caracterizacion de la region promotora

BIEDMA, M.E; CARREA, A.; SALVADOR, R; BERRETA, MF; SCIOCCO-CAP, A; ROMANOWSKI, V

Buenos Aires

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología; 2008

El gen ie-1 (immediate early 1) está presente en la mayoría de los miembros de la familia Baculoviridae. Los estudios sobre este gen demuestran que desempeña un rol crítico en el desarrollo del ciclo viral. Su transcripción es dependiente de la RNA polimerasa II celular y comienza en la etapa más temprana del ciclo. Se ha demostrado, en virus modelo, que la proteína IE-1 está involucrada en diversos mecanismos de regulación incluyendo la replicación del ADN genómico del virus. Las características regulatorias particulares descriptas en AcMNPV, su importancia en diversos procesos virales, y su temporalidad de activación hacen que este gen sea considerado un elemento clave en el diseño de baculovirus modificados para su desarrollo como sistemas de control biológico así como también sistemas de expresión de proteínas heterólogas.Hemos identificado y secuenciado un gen homólogo a la proteína IE-1 en el genoma del virus de la granulosis de Epinotia aporema (EpapGV). El mismo se localizó entre 28.5 y 29.5 unidades de mapa del mapa físico de EpapGV. El análisis de la secuencia nucleotídica indica que el marco abierto de lectura consiste de 1194 nt y codifica una proteína de 398 aminoácidos. La secuencia aminoacídica deducida, indica que este gen comparte una variedad de motivos similares a los encontrados en otros baculovirus, asociados al proceso de transactivación. Este resultado concuerda con investigaciones previas que establecen que la región C-terminal es la más conservada en el conjunto de las proteínas IE-1 de los nucleopoliedrovirus. El análisis filogenético realizado con las secuencias disponibles de las proteínas homólogas, nos indica que IE-1 de EpapGV está estrechamente relacionado a Choristoneura fumiferana GV.Con el objetivo de verificar la funcionalidad de la región promotora, hemos insertado la secuencia de 600 pb upstream del codón de inicio de la traducción de ie-1 delante del ORF de la ß-galactosidasa de E. coli, en el plásmido pCH110. La actividad del mismo fue identificada mediante ensayos de expresión transitoria, por transfección de células derivadas de Anticarsia gemmatalis (UFLAg-286) y Spodoptera frugiperda (Sf9), líneas celulares heterólogas, dado que no se cuenta con una línea celular derivada de Epinotia aporema. El revelado se realizó a distintos tiempos pos-transfección, mediante tinción histoquímica con el sustrato colorimétrico X-gal. Los resultados indicarían que esta región puede activar la expresión del gen marcador,al ser reconocido por la maquinaria transcripcional de las células hospedantes derivadas de lepidópteros distintos a E. aporema. Han sido reportados varios homólogos del gen ie-1 en NPVs y GVs, sin embargo, no se ha avanzado en la caracterización funcional de este gen en Granulovirus. En este trabajo se analiza el gen ie-1 de un Granulovirus: su secuencia aminoacídica y su función en células derivadas de A. gemmatalis y S. frugiperda.